应用生物发光法监测CD4^+细胞三磷酸腺苷水平评估肝移植术后患者的免疫功能

目的:评估三磷酸腺苷生物发光法检测肝移植受者早期CD4+细胞免疫功能的变化。方法:选择2004-06/10在解放军第二军医大学长征医院器官移植研究所进行的30例肝移植受者手术前后(0,1,2,4周)和50例健康志愿者。采用三磷酸腺苷生物发光法通过植物凝血素刺激后CD4+细胞三磷酸腺苷量的变化来监测细胞的免疫功能。①三磷酸腺苷标准品的检测:用培养基将三磷酸腺苷标准品配制成系列浓度:1,10,1×102,1×103和1×104μg/L,加入等量的Celltiter-GloTM荧光试剂混匀,取200μL进行测定,取对数制作标准曲线。②样本三磷酸腺苷检测:采集两组人员全血样本(肝素抗凝),置于细胞培养板过夜,加入含有洗涤过的抗人CD4单抗免疫磁粒悬浮液,用磁珠强效分离磁架将CD4+细胞吸于培养孔的一侧,用磷酸盐缓冲液洗3～5次,加入培养基(+体积分数为0.1的胎牛血清),加入Celltiter-GloTM试剂,1h内用荧光仪(发射波长562nm)读取荧光发光信号,计算其平均数值。③外周血T淋巴细胞亚群检测:肝素钠抗凝血加相应的抗体,放于Q-prep,workstation上处理后上机,计算出阳性细胞的百分率;或标记后的标本同样处理后,加混匀的Flow-Count标准荧光小球到标本管2h内上机,计算出CD4+细胞的绝对计数。④检测他克莫司血药浓度。结果:①在三磷酸腺苷浓度为1×(100～104)μg/L之间时,三磷酸腺苷标准品与荧光发光信号呈线性关系。直线方程为Y=0.75X+2.37(r=0.99484)。②移植组患者三磷酸腺苷明显低于健康人群犤(350±191),(735±370)μg/L,P<0.05犦,术后1周显著下降为(161±107)μg/L,而后逐渐提高。表明肝移植受者的细胞免疫功能术后第1周明显下降,以后逐渐恢复,第4周仍低于术前水平。③反应细胞免疫功能的三磷酸腺苷量与免疫抑制剂他克莫司血药浓度缺乏直接的相关性(r2=0.02)。结论:三磷酸腺苷生物发光法有利于正确评估肝移植后患者的细胞免疫功能。