不同分离方法与培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况比较

目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的骨髓间充质干细胞的影响,试图寻找获得高质量、高活性的骨髓间充质干细胞的培养条件。方法:实验于2005-09/2006-01在解放军第四军医大学实验动物中心实验部进行。①SPF级雄性Wistar大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组,3只/组。密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组。②骨髓取材:各组大鼠断颈处死后,无菌取双下肢,剔除股骨、胫骨周围肌肉组织,剪去骨干的两端,暴露骨髓腔,穿刺两侧骨端取出骨髓。③贴壁分离法:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组大鼠分别采用相应的血清和培养基冲洗骨髓,制备单细胞悬液,接种于培养瓶中,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每3～4d换液1次。④密度梯度离心法:Ficoll分离液组选用的Ficoll分离液密度为1.077;Percoll分离液组将Percoll分离液与0.1mol/L磷酸盐缓冲液按9∶1比例混匀,密度为1.073。将两组大鼠骨髓置入离心管,离心弃上清,轻轻叠加到相同体积的各自对应分离液上,再次离心收集界面层白色混浊液,采用F12-DMEM培养液重悬细胞,按1×109L-1的密度接种于培养瓶中,培养条件与贴壁分离法相同。⑤指标检测:倒置显微镜下,每天观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的生长情况和活体形态特征。进行锥虫蓝排斥试验,蓝染细胞为死亡细胞,在3min内用计数板分别计数活细胞和死细胞,未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活性的数据。两种分离方法均取生长良好的第3代细胞,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。结果:18只大鼠均进入结果分析。①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基后则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞。密度梯度离心法:Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形骨髓间充质干细胞,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长。②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清+DMEM组、进口血清+F12-DMEM组、国产血清+DMEM组、国产血清+F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(χ2=0.054～0.620,P均>0.05)。密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似(96.9%,97.1%,t=1.066,P>0.05)。③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;4d后细胞数均迅速增长;8d进入平台期,细胞增殖减慢。结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得骨髓间充质干细胞,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好。

2080例药物中毒门诊病例分析

本文对 2 0 80例门诊药物中毒病例进行流行病学分析 ,了解就诊病例药物中毒性别、年龄、文化程度、职业分布、季节性的构成比 。

乙型肝炎病毒S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞核内的表达

目的探讨细胞核显微注射导入外源基因的方法,观察HBV-S基因导入人肝癌细胞株SMMC-7721后的表达及其稳定性。方法将含有HBV-S片段的质粒pCR3.1-S线性化,通过显微注射仪直接注入培养的SMMC-7721细胞核内,G418筛选后,经EIA和免疫荧光法分别检测细胞培养上清和细胞内HBsAg的表达。结果每注射100～150个细胞可筛选出一个阳性克隆,3个阳性克隆经扩大培养后,其中1个克隆的培养上清经EIA法检测HBsAg阳性,免疫荧光显示细胞膜及细胞质均有HBsAg表达,并持续6mo以上。结论 HBV-S基因经显微注射导入SMMC-7721细胞后获得持续稳定的表达。

肝干细胞研究现状

肝干细胞具有双分化潜能,可向肝细胞和胆管上皮细胞分化发育;胚胎期肝干细胞来源于肝始基,成年期肝干细胞可能来源于Hering管细胞和骨髓造血干细胞;细胞间作用和细胞基质间作用对于肝干细胞的分化成熟起重要作用;肝干细胞在肝脏疾病的基础研究和临床治疗方面具有广阔的应用前景。

急性肝衰竭大鼠肝细胞移植的实验研究

目的:探讨大鼠同种异体肝细胞经腹腔、脾脏、门静脉移植对药物性急性肝衰竭大鼠的治疗作用. 方法:D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭后60 h,分6组进行治疗实验.Ⅰ组:腹腔内移植2×1010/L肝细胞悬液1 mL;Ⅱ组:腹腔内注射生理盐水1 mL;Ⅲ组:经门静脉注射2×1010/L肝细胞悬液1 mL;Ⅳ组:经门静脉注射生理盐水1 mL:Ⅴ组:向脾脏内移植2×1010/L肝细胞悬液1 mL; Ⅵ组:脾内注射生理盐水1 mL.移植同时各组大鼠肌肉注射环孢霉素A(CsA)10 mg/kg,观察大鼠的存活率、肝脏功能和肝脏病理变化情况. 结果:Ⅰ组大鼠存活率比Ⅱ组有明显提高(60%对20%, P<0.01),肝脏功能及肝脏病理明显改善.Ⅲ组大鼠存活率与Ⅳ组无显著差异(20%对13.3%,P>0.05),肝脏功能及肝脏病理未见改善.Ⅴ组与Ⅵ组比较存活率有提高(47% 对20%,P<0.05). 结论:经腹腔及脾脏移植同种异体肝细胞可明显改善D-gal 诱导的肝衰竭大鼠的存活率,部分改善肝功能及肝脏病理;经门静脉移植同种异体肝细胞不能改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率、肝脏功能及肝脏病理.

免疫缺陷小鼠肿瘤模型的建立及其肿瘤相关免疫机制的探讨

目的:观察不同免疫缺陷小鼠中的人肝癌细胞生长情况以及T,B淋巴细胞的免疫作用,探讨免疫缺陷小鼠肿瘤模型制作的意义。 方法:将体外培养的人肝癌细胞接种到四种免疫缺陷小鼠,分别为:B细胞缺陷的CBA/N,T细胞缺陷的Balb/c-nu,T,B细胞缺陷的SCID及免疫重建的SCID小鼠,观察其生长特点;作鼠脾细胞毒试验,测定外周血CD4^+,CD8^+数分数和荷瘤鼠血清Ig含量的变化;作肝癌细胞凝集试验。 结果:CBA/N和用BALB/c鼠外周血淋巴细胞重建的SCID(B-PBL-SCID)鼠不成瘤,nude、SCID和用CBA/N鼠外周血淋巴细重建的SCID(C-PBL-SCID)小鼠全部成瘤;SCID鼠的瘤体比裸鼠瘤体长的更快,肝内接种转移率更高、转移范围更大。接种瘤细胞的BALB/c和CBA/N鼠脾细胞对癌细胞杀伤力较强,免疫重建的SCID鼠脾细胞毒杀伤较小。接种瘤细胞的鼠CD4^+数分数都下降,CD8^+变化不大,CD4^+/CD8^+比值下降。具有B细胞的实验鼠均测得Ig在mg·L^(-1)水平,并能使癌细胞产生凝集反应。 结论:SCID鼠是建立肿瘤模型和免疫重建研究的理想小鼠;小鼠成瘤率与T细胞相关,T细胞在异种瘤移植排斥中起主要作用;B淋巴细胞及其产生的抗体在抗肿瘤中起着不可忽视的作用。

抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体的构建及评评价

目的构建抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体,并验证其表达效率及功能。方法通过PCR方法将鱼精蛋白截短片段序列与抗黑色素瘤细胞表面抗原单链抗体基因相连接;采用TaKaRap MD19-T载体试剂盒将PCR后获得的融合蛋白扩增产物进行T载体构建;构建GST融合蛋白表达载体以实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,经两步亲和纯化后获得scFv-tP蛋白;采用凝胶阻滞电泳迁移率变动分析EMSA技术检测Anti-MM scFv-tP与siRNA的结合活性;荧光分子标记scFv-tP蛋白后分别采用流式细胞术检测和共聚焦显微镜观察其与Li Br细胞株进行细胞表面抗原结合活性验证;采用不同浓度FITC标记的siRNA与scFv-tP进行混合,分别与LiBr细胞(A)及DU145细胞(B)进行混合孵育,观察肿瘤细胞对携载siRNA的单链抗体的内化活性。结果成功构建抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白(Anti-MM scFv-tP)表达载体;实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,可获得较纯的scFv-tP蛋白;Anti-MM scFv-tP蛋白与siRNA有明显的结合与携载能力,可以有效与LiBr细胞表面特异性抗原进行结合,且有较强的内化活性。结论本研究构建的抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体可稳定表达,Anti-MM scFv-tP蛋白具有siRNA结合携载能力,可靶向识别结合进入LiBr细胞,为后续进一步研究该单链抗体融合蛋白靶向载体携载siRNA在体内外抑制恶性黑色素瘤恶性进展奠定坚实的基础。

人多形上皮黏蛋白与巨噬细胞集落刺激因子基因融合构建双基因多表位抗原的真核共表达质粒(英文)

背景:一些实验已经证明在同一载体上构建含多个基因的共表达载体,可提高转染和表达效率。目的:利用多形上皮黏蛋白(polymorphic epithelial mucin,MUC1)多肽骨架中含有许多连续重复系列,构建人MUC1重复序列串联体基因与巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。设计、时间及地点:基因重组体设计实验,于2005-09/2006-12在解放军第四军医大学动物中心实验室完成。材料:真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Taylor-Papadimitriou教授惠赠,pGEM-3zf(-)-GM-CSF质粒、COS-7细胞、pUC18载体及E.coli DH5α为自备,雌性BALB/c小鼠由解放军第四军医大学实验动物中心提供。方法:将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片断经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1(+)-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞。主要观察指标:通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果:酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。结论:成功构建了人MUC1基因重复序列串联体与免疫佐剂GM-CSF基因重组成为双基因多表位抗原的真核共表达质粒。

凯娜英犬五联活疫苗大面积使用后的反应和效果观察

凯娜英犬五联活疫苗大面积使用后的反应和效果观察吕晓星丁国华齐匀正李六金（湖南省兽医总站，长沙４１０００７）（解放军第四军医大学动物实验中心）１９９４～１９９６年，湖南省兽医总站在本省部分地、市使用西安第四军医大学实验动物中心研制试产的凯娜英犬五联苗，...

疫苗用犬瘟热弱毒株毒力返祖试验

以 10代犬瘟热病毒 (CDV XN112 )弱毒株第 5代细胞种毒接种 3 0日龄健康犬 ,对其遗传稳定性、安全性进行试验。结果表明 ,CDV XN112 毒株连传 3代 ,接种犬临床无任何异常 ,精神、食欲、体温均正常 ;解剖后检查 ,肺门淋巴结、肝、肾、心、脾、肠也无组织病理学变化 ,血样电镜观察到较多典型CDV病毒粒子 ,TCID50 达 10 -4 .5,用此病毒接种MA 10 4Vero细胞单层 ,产生典型细胞病变 (CPE)。

前列腺癌体内实验模型的研究进展

前列腺癌是男性最为常见的恶性肿瘤之一。近年来有关前列腺癌的相关研究取得了较大突破,但由于缺少有效的体内实验模型,导致研究成果向临床应用的转化受到严重阻碍。人源性前列腺癌移植(patient derived prostate tumor xenograft,PDPTX)模型是将患者新鲜的肿瘤组织移植于免疫缺陷小鼠而建立的体内模型,该模型能较好地复制原发肿瘤的异质性,保持肿瘤在分子学、基因学和病理学的复杂性。特别是采用肾包膜移植建立PDPTX模型的方法较好地解决了传统皮下移植建模成功率低、低级别肿瘤成瘤难、无法实现移植瘤转移等缺点,为前列腺癌研究提供了更为理想的体内模型。尤其是在靶向治疗、新型药物筛选、个体化治疗等方面具有不可取代的优势。

骨碎补总黄酮对大鼠成骨细胞增殖、分化及细胞外信号调节激酶表达的影响

目的观察骨碎补总黄酮（totalflavonoidsindrynariafortunei，TFDF）对大鼠成骨细胞增殖、分化及细胞外信号调节激酶（extracellularsignal．regulatedkinase，ERK）表达的影响。方法选择10月龄SD雄性大鼠，按体质量采用随机数字表法分为5组：空白对照组，阳性对照组，低、中、高剂量组，每组8只。空白对照组给予等溶生理盐水灌胃；阳性对照组给予蒸馏水配制的骨松宝溶液，灌胃剂量为5．710g·kg-1·d-1；低、中、高剂量组给予蒸馏水配制的TFDF溶液，灌胃剂量分别为0．054、0．108、0．216g·kg-1·d-1。5组连续灌胃8d，末次灌胃后1．5h，大鼠麻醉处死，无菌心脏取血，提取上清，同组混匀，56℃水浴30min灭活补体，滤膜除菌分装血清用于成骨细胞培养。成骨细胞来自3～5日龄SD乳鼠股骨，DMEM培养液冲洗骨髓腔，吹打制备单细胞悬液，采用三维细胞培养系统体外培养大鼠成骨细胞。在无血清DMEM培养后，分别用含上述血清的培养基培养，采用倒置相差显微镜观察成骨细胞形态学变化，噻唑蓝（MTT）法检测成骨细胞增殖情况，对硝基苯磷酸盐（PNPP）法测定碱性磷酸酶（AIP）活性，PCR法测定ERK1、ERK2mRNA表达。结果成骨细胞增殖能力组间比较差异有统计学意义（F=8．850，P〈0．05），其中阳性对照组，低、中、高剂量组（0．329±0．004、0．302±0．038、0．342±0．010、0．353±0．006）明显高于空白对照组（0．272±0．005，P均〈0．05）。中、高剂量组高于低剂量组（P均〈O．05）。成骨细胞ALP活性组间比较差异有统计学意义（F=13．406，P〈0．05），其中阳性对照组，中、高剂量组[（15．60±0．38）、（14．62±0．36）、（13．48±0．18）U／mgpro]明显高于空白对照组、低剂量组[（6．34±0．16）、（8．68±0．35）U／mg pro，P均〈0．05]，低剂量组高于空白对照组（P〈0．05）。成骨细胞ERKl、ERK2mRNA表达组间比较，差异有统计学意义（F=19．452、15．306，P均〈0．05），其中阳性对照组（2．407±0．022、2．026±0．014）、中剂量组（2．385±0．018、2．018±0．020）明显高于空白对照组（1．032±0．016、0．968±0．018，P均〈0．05）。结论TFDF可促进成骨细胞的分化成熟，其作用机制可能与ERK通路相关。