Flt3配体胞外域的原核表达纯化及对脐血CD34^+细胞的扩增作用

背景:Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)是一种重要的生长因子,通过激活特定的酪氨酸激酶受体,调控造血细胞的生长、生存和/或分化,具有促进造血干细胞体外扩增的应用潜力。目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,表达、纯化hFLext蛋白,观察其对脐血CD34+细胞的扩增作用。方法:克隆hFLext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白。磁珠分选脐血CD34+细胞,单独加入hFLext或联合干细胞因子、血小板生成素孵育1周,观察体外扩增作用。结果与结论:成功克隆hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体。在大肠杆菌BL21成功表达Trx-hFLext融合蛋白,经8mol/L尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白。Trx-hFLext融合蛋白不仅具有维持及轻度刺激CD34+细胞体外扩增的作用,并且与干细胞因子及血小板生成素具有协同作用,为造血干/祖细胞体外扩增研究奠定了基础。

HCV胞膜蛋白E2基因的融合表达、纯化及多克隆抗体制备

目的原核表达HCV胞膜蛋白E2,获得抗E2多克隆抗体。方法利用PCR方法从HCV基因组序列中扩增出831bp(384～661aa)的E2基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导HCVE2蛋白表达,SDS-PAGE和WesternBlot法检测蛋白表达,Ni-NTA偶联的琼脂糖吸附柱纯化融合蛋白,薄层扫描及Bradford法检测纯化蛋白的纯度>90%;用表达的E2蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测抗体效价,WesternBlot法检测抗体特异性。结果用原核诱导表达出HCV胞膜蛋白E2免疫新西兰兔后获得多克隆抗体的效价在1∶1280以上,能特异性识别E2蛋白。结论成功构建HCVE2基因的原核表达载体,利用原核表达HCV胞膜蛋白E2制备的多克隆抗体能特异性识别E2蛋白。为进一步开展HCVE2蛋白功能和HCV受体的研究奠定了基础。