釉基质蛋白对牙周膜成纤维细胞合成蛋白的影响

目的:检测釉基质蛋白作用下牙周膜成纤维细胞合成蛋白的变化,分析釉基质蛋白促进牙周组织再生的作用。方法:实验于2004-04/08在第四军医大学口腔医院组织工程实验室完成。选取11～14岁儿童因正畸需要拔除的无牙周病及龋病的健康新鲜前磨牙,锐利刀片刮除牙根颈部1/3牙龈及牙周膜,采用全牙胶原酶消化法培养获得牙周膜成纤维细胞,经免疫细胞化学检测证实为外胚间充质细胞。取第3代细胞用于实验,分为2组:对照组为含10mL/L新生牛血清的低糖DMEM培养液,实验组为100mg/L釉基质蛋白,用含10ml/L新生牛血清的低糖DMEM培养液配制。将第3代人牙周膜成纤维细胞制备成密度为1×104/mL的细胞悬液,接种入预先放置有细胞爬片的6孔板中,24h后按实验分组更换诱导液。逐日倒置显微镜下观察细胞形态。第3,7天利用免疫组化方法和图像分析技术检测两种细胞骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、牙骨质附着蛋白的表达。结果:①细胞形态学观察:加入诱导因子初期细胞形态无明显变化,随时间延长,实验组细胞突起逐渐变短,与对照组相比有明显差异。②免疫细胞化学检测结果:对照组骨涎蛋白、骨桥蛋白呈弱阳性到阳性表达,实验组与对照组相比,骨涎蛋白、骨桥蛋白均呈现不同程度胞浆着色加深,与作用时间成正比。对照组细胞骨粘连蛋白基本为阴性表达,而实验组细胞第3天时即检测到了骨粘连蛋白的表达,且随时间的延长染色加深。未经釉基质蛋白处理的牙骨质附着蛋白抗体为阴性表达,经过釉基质蛋白作用第3,7天均检测到牙骨质附着蛋白抗体的弱阳性表达,胞浆着色呈淡棕黄色。设立的空白对照和阴性对照均未见着色。③釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞合成骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的影响:与对照组比较,实验组第3,7天骨涎蛋白和骨桥蛋白均明显上调(184.31±5.67,168.20±6.93;181.42±4.99,163.91±5.86;213.02±5.40,194.81±5.06;211.12±5.59,182.06±6.66;P均<0.01),骨粘连蛋白对照组未表达,实验组第3天时检测到表达;实验组第7天骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白上调幅度均明显高于第3天(163.91±5.86,168.20±6.93,P<0.05;182.06±6.66,194.81±5.06,P<0.01;196.73±5.47,204.67±5.12,P<0.01)。结论:釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞具有上调骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的作用,随时间延长这种促进作用愈明显;并能诱导细胞表达牙骨质附着蛋白。釉基质蛋白在一定浓度下可使人牙周膜成纤维细胞向成骨、成牙骨质样细胞分化。