构建组织工程皮肤种子细胞的人血管内皮细胞的培养

目的探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的人血管内皮细胞,以作为构建含血管组织工程皮肤的种子细胞。方法以新生儿脐带静脉作为细胞来源,用消化法获得血管内皮细胞,用本实验室设计的方法对细胞进行纯化培养,倒置显微镜观察细胞形态,结合免疫组化检测(第Ⅷ因子)和透射电镜(Weibel-Palade小体)鉴定细胞来源。结果用本实验室的纯化方法获得的血管内皮细胞未见成纤维细胞污染,细胞增殖旺盛,处于良好的生长状态。结论结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度血管内皮细胞,可以用于含血管组织工程皮肤的构建。

角蛋白CK10和CK19在组织工程皮肤和正常在体皮肤表达差异的意义

目的观察角蛋白CK10和CK19在组织工程皮肤和正常在体皮肤的表达,并探讨其差异表达的意义。方法用组织工程方法构建人全层皮肤,以正常在体皮肤为对照,免疫组化检测CK10和CK19在表皮层的表达。结果在组织工程皮肤中CK10表达阳性,CK19无明显阳性表达;正常在体皮肤CK10和CK19表达皆为阳性,其中CK19主要表达在基底膜附近。结论组织工程皮肤中表皮层细胞已经基本丧失了组织干细胞的特性,分化成熟。

简便快捷获取角朊细胞和真皮成纤维细胞:组织工程皮肤种子细胞培养的3种方法比较(英文)

目的:探讨如何以简便快捷的方法获得大量最佳生长状态的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞。方法:用2.5g/L胰酶、35g/L热溶素和9.0×103U/LDispase分别在A,B,C不同条件下处理皮肤标本,观察表皮与真皮的分离情况,并分别培养角朊细胞和真皮成纤维细胞,观察比较细胞的贴壁率和克隆形成率,通过MTT和BrdU检测观察细胞的生长状态,并分别用不同方法获得的细胞构建组织工程皮肤。结果:A,B,C3种方法角朊细胞的贴壁率(%)分别为:8.7±0.2,12.1±0.2,15.9±0.4;成纤维细胞的贴壁率(%)分别为:20.2±2.4,30.5±1.8,38.3±1.9。组间比较差异有统计学意义(t=3.3506,t0.05/2,18=2.101,P<0.05)。角朊细胞克隆形成率(%)分别为:0.110±0.025,0.260±0.026,0.370±0.021。组间比较差异有统计学意义(t=2.2875,t0.05/2,18=2.101,P<0.05)。在各种条件下,Dispase处理组获得的细胞数量、细胞贴壁率和克隆形成率均优于其他消化液处理组,细胞纯度高,生长状态良好;用其他方法获得的细胞生长状态相似,都可成功构建组织工程皮肤。结论:使用9.0×103U/LDispase可以简便快捷的获得大量生长状态良好的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞,合适的消化方法。

组织工程皮肤修复皮肤缺损成功率与手术方法的相关性(英文)

背景:皮肤缺损的常规修复方法多采用自体皮肤移植,需要健康供皮区且会遗留不同程度的瘢痕畸形。组织工程皮肤的成功构建并应用于临床,标志着皮肤缺损治疗的重大突破。目的:通过组织工程皮肤修复皮肤缺损,分析手术方法与愈合率的关系,为组织工程皮肤的临床应用提供实验依据。设计:随机对照观察。单位:解放军第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科,组织病理学教研室,组织工程实验中心。材料:实验于2003-10/2004-03在解放军第四军医大学口腔医学院口腔组织工程实验中心完成。选用2.5～3月龄健康清洁级约克猪6只,随机分为3组:组织工程全层组、组织工程真皮+自体表皮组、自体移植组,2只/。每只猪制作8个直径50mm的圆形皮肤缺损创面,16个创组面/组,共48个创面。方法:①制备组织工程全层皮肤和组织工程真皮。②组织工程全层组:沿画线自脂肪层切除全厚皮肤,彻底止血,以湿生理盐水纱布覆盖创面备用,此时取出组织工程全层皮肤并于组织工程皮肤上均匀打引流孔以利引流,用生理盐水冲去组织工程皮肤表面的培养液,使表皮层向上平铺于创面上,注意与创面间不能产生气泡。其上分别覆盖单层油纱布,生理盐水纱布、无菌干纱布、弹性海绵垫,每层厚度约为3～5mm,常规打包包扎,最后再以弹性绷带加压包扎。③组织工程真皮+自体表皮组:以同样方法切除全厚皮肤,将取下的皮肤用取皮鼓反取厚约0.1～0.2mm的刃厚表皮泡于生理盐水中备用。以同样方法取出处理组织工程真皮后覆盖于创面上,即刻覆盖自体刃厚表皮。其余处理同组织工程全层组。④自体移植组:切除全厚皮肤并去除脂肪组织后,回植于自体创面,覆盖各层敷料,加压包扎。⑤每次换药打开创面时,移植皮肤无感染、坏死、脱落且直径不小于3mm即为成活,否则即为失败。于术后4周统计各组创面成活率。主要观察指标:术后4周各组移植皮肤成活情况。结果:术后4周时,组织工程全层组移植皮肤成活率75%,组织工程真皮+自体表皮组移植皮肤成活率87%,自体移植组移植皮肤成活率94%,3组比较基本相似(χ2=2.34,P>0.05)。结论:组织工程皮肤移植修复皮肤缺损的效果与自体表皮移植接近,证明组织工程皮肤修复皮肤缺损是可行的。

两段法培养适合临床移植应用的黑素细胞的安全性研究

目的:探讨使用两段法培养黑素细胞,以消除佛波醇酯(TPA)的致瘤危险,增加培养细胞的安全性,从而适合临床移植的需要。方法:两段法培养黑素细胞:先用含TPA培养液培养纯化黑素细胞,然后用不含TPA的培养基继续扩增传代。通过细胞形态、生长特性、细胞周期等检测观察有无TPA时培养细胞的特性。接种裸鼠检测培养细胞的致瘤性。结果:用含TPA培养液容易获得纯化的黑素细胞;扩增传代时改用不含TPA的培养基,黑素细胞由细长的多分支逐渐变成两极的宽梭形。生长速度略微减慢,细胞周期显示增殖减缓。裸鼠致瘤实验阴性。结论:两段法培养黑细胞成功率高,和以往培养基中含TPA的培养方法相比,所培养黑素细胞形状变化明显,生长减慢,用于临床移植时更加安全。

外周血来源间充质干细胞的成骨及成脂诱导分化

目的：目前对于是否存在外周血来源间充质干细胞备受争议。实验拟进一步探讨在皮肤损伤与非损伤条件下,外周血来源间充质干细胞的分离培养及其成骨、成脂多向分化特性。方法：实验于1996-08/1997-11在解放军第四军医大学组织工程研发中心完成。①动物：清洁级SD大鼠24只,随机数字表法分为正常组、创面组,12只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：创面组大鼠麻醉后,背部切去3cm×3cm全层皮肤,建立创伤模型。术后5d,两组大鼠腹主动脉抽血,8mL/只,加入含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基,密度梯度法分离培养外周血来源间充质干细胞。取大鼠双侧股骨、胫骨,全骨髓法分离培养骨髓来源间充质干细胞作为对照。③实验评估：培养至第12天,计数原代培养每1×10^5个外周血单个核细胞所形成的间充质干细胞克隆数。取第3代外周血间充质干细胞,行CD45、CD34、Ⅰ型胶原免疫组织化学鉴定细胞表型;按1×10^4密度接种于12孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以茜素红、油红染色检测其分化特性。结果：①细胞形态观察：原代培养的外周血来源间充质干细胞呈成纤维样。②克隆形成：外周血来源间充质干细胞形成的克隆数仅为骨髓来源间充质干细胞的1/6-1/8,创面组外周血间充质干细胞形成的克隆数是正常组3-4倍。③细胞表型鉴定：外周血来源间充干细胞CD45、CD34呈阴性,Ⅰ型胶原呈阳性。④成骨及成脂诱导：外周血间充质干细胞成骨诱导后21d出现钙沉积,茜素红染色呈阳性;成脂诱导后14d有少量脂滴出现,油红染色为阳性。结论：①皮肤损伤状态下外周血间充质干细胞克隆数量是正常条件的3-4倍,但仍远低于骨髓来源间充质干细胞的克隆能力。②体外分离培养的外周血间充质干细胞具备成骨、成脂分化特性。

从人外毛根鞘细胞分离获取黑素母细胞

目的:毛囊黑素细胞是皮肤黑素细胞的储库,含有黑素母细胞甚至黑素干细胞,具有更强的增殖潜力。观察人毛囊外毛根鞘细胞中黑素细胞的分布特征,尝试分离获取黑素母细胞。方法:实验于2003-04/2006-04在解放军第四军医大学组织工程实验中心和武警医学院附属医院皮肤科完成。消化游离流产胎儿头皮(产妇同意由医院处理流产胎儿)毛囊,用黑素细胞培养基接种,原代培养人外毛根鞘细胞,并观察外毛根鞘细胞和黑素细胞的分布。待原代外毛根鞘细胞融合时,加入胰酶消化,大约一半细胞漂浮时,加入含体积分数为0.10小牛血清的DMEM终止,轻柔吹打,弃去飘浮细胞。用DMEM清洗原瓶后加入黑素细胞培养基,继续培养,寻找黑素(母)细胞克隆。并采用胰酶消化法纯化培养黑素细胞。结果:在贴壁生长的毛根周围发现了外毛根鞘细胞团,以毛囊隆突部位为中心呈纺锤形排列。其中含有黑素细胞:临近毛囊漏斗部和毛球部的黑素细胞体积较大,有两个或者多个长一些的树突;隆突部位周围的黑素细胞体积偏小,树枝少而短。经纯化培养获得黑素(母)细胞集落,集落中心细胞呈短梭形,折光性很强,排列密集,增殖活跃;边缘细胞变大,树突延长;集落之间散在分布的黑素细胞体积更大,树突延长,数量增多至3个以上。结论:实验观察到人毛囊外毛根鞘细胞中有黑素细胞分布,并选择性培养获得黑素细胞克隆,分析克隆中心可能含有黑素母细胞。

皮肤细胞悬液移植的基础研究:人黑素细胞膜片体外附着生长观察

目的:观察黑素细胞与BioFOLIE膜的亲和性,体外建立黑素细胞膜片,为改进细胞移植治疗白癜风做好准备。方法:把黑素细胞接种于BioFOLIE膜上,观察细胞生长形态,扫描和投射电镜观察黑素细胞和BioFOLIE膜的贴附状况。把接种黑素细胞的BioFOLIE膜按常规冻存到液氮中,复苏后观察黑素细胞的生长。结果:黑素细胞接种于BioFOLIE膜后很快贴壁。黑素细胞伸展充分,和六孔板中培养的黑素细胞形态类似。扫描电镜发现黑素细胞贴附很好,有长的树突形成。透射电镜可见细胞BioFOLIE膜粘贴紧密,膜表面形成小的裂隙,裂隙中有黑素颗粒。黑素细胞以膜片形式冻存复苏后大部分细胞存活,仍能培养传代。结论:黑素细胞在BioFOLIE膜上贴附快,伸展好,分泌黑素颗粒功能正常。两者亲和性好。用BioFOLIE膜制备的黑素细胞膜片观察容易,并能够冻存备用,使用方便。