转录因子MSX-1对人牙乳头间充质细胞增殖在牙胚发育中的意义

目的观察体外培养的人牙乳头间充质细胞经转化生长因子β1(TGF-β1)作用下,肌节同源盒基因1(MSX-1)的表达变化,探讨MSX-1基因在牙胚发育中的意义。方法第5代体外培养的人牙乳头间充质细胞经50μg/L的TGF-β1刺激后,MTT方法及流式细胞仪分析观察对照组、TGF-β1处理组细胞的增殖变化,原位杂交检测两组细胞中MSX基因扩增水平的变化。结果实验组细胞培养3d细胞增殖为0.44±0.03,培养5d为0.53±0.05,培养7d为0.83±0.07,与对照组比较差异具有显著性意义(P<0.01,t=6.603,6.562,6.052)。对照组G1期细胞为94.7%,S期细胞为4.0%,G2M期细胞为1.3%,实验组细胞中的G1期降低(83.8%),S期升高(7.8%),G2M期细胞升高(9.3%)(t=5.327,P<0.01),反映细胞增殖活力的增殖指数PrⅠ值(S+G2M)对照组为5.3,实验组为17.1两者相比有显著差异(t=7.327,P<0.01)。结论MSX基因有可能在TGF-β1的调控下表达,对人牙乳头间充质细胞的增殖分化可能具有重要的调节作用。

成牙本质细胞中成纤维细胞生长因子18的表达

目的:观察成牙本质细胞中是否表达成纤维细胞生长因子18。方法:实验于2005-02/04在解放军第四军医大学口腔医院口腔内科实验室完成。①小鼠成牙本质样细胞系MDPC-23培养:细胞培养在含体积分数为0.1的胎牛血清α-MEM、青霉素l00IU/mL、链霉素l00mg/L和谷氨酰胺50mg/L的完全培养液中,同时附加50mg/L抗坏血酸。②免疫组织化学染色:一抗用1∶100稀释的成纤维细胞生长因子18多克隆抗体,4℃湿盒过夜,最后滴加二氨基联苯胺液显色。以磷酸盐缓冲液代替一抗设为阴性对照。成纤维细胞生长因子18阳性表达细胞胞浆呈棕黄色。③免疫荧光染色:一抗用1∶50稀释的羊抗小鼠成纤维细胞生长因子18多克隆抗体,4℃湿盒过夜后滴加按1∶500稀释的FITC标记的兔抗羊二抗。阴性对照用磷酸盐缓冲液代替一抗进行染色。成纤维细胞生长因子18阳性表达细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。结果:免疫荧光和免疫组织化学法均表明成纤维细胞生长因子18在MDPC-23细胞浆呈阳性表达。结论:从蛋白水平证实了成牙本质样细胞MDPC-23表达成纤维细胞生长因子18,提示成纤维细胞生长因子18可能是影响成牙本质细胞分化的胞内信号转导分子。

人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞向永生化细胞的转变

背景：颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源，如何使其获得永生化具有重要意义。人类细胞自发永生化的频率非常低，而一些永生化的基因可以显著增加这种频率。目的：观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用。设计、时间及地点：观察性实验，于2007—09／2008-06在解放军第四军医大学完成。材料：选择清洁级孕8．5dSD大鼠3只，6周，体质量180g；先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb／c裸小鼠，体质量18～21g，均由解放军第四军医大学实验动物中心提供。质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供。方法：原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后，将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞。经G418筛选后扩增，并连续培养。采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达，检测细胞的端粒酶活性，绘制细胞生长曲线观察其增殖能力，并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性。主要观察指标：细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果。结果：①质粒PCIneo—hTERT转染细胞后24h，有少量细胞死亡。加G418后48h，细胞逐步开始大量死亡。12d后出现抗性细胞克隆，共有3个细胞克隆生长良好。分别命名为克隆1、2、3。克隆1和克隆2经过20～25代的传代后，细胞发生衰老、死亡：而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好，稳定表达人端粒酶催化亚基和P75。经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高，且能持续表达。②人端粒酶催化亚基基因转染后，3个细胞克隆在初期的增殖能力较强，随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢，出现死亡，克隆3越过衰老期，且无致瘤性。结论：人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后，细胞得以永生化，其表型稳定，可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞。