地高辛素标记探针原位杂交技术检测肝硬变组织中TIMPs mRNA

目的金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)具有抑制金属蛋白酶(MMPs)的作用,为了阐明TIMP-1和TIMP-2在肝硬变患者肝组织中的表达水平及分布状态。我们检测了肝硬变患者肝组织中的TIMP-1和TIMP-2,探讨TIMP-1和TIMP-2在肝硬变发病机制中的作用。方法以TIMP-1和TIMP-2 cDNA探针为试剂。采用原位杂交技术检测40例经肝组织病理学检查证实为结节性肝硬变患者肝组织中(其中男32例.女8例,平均年龄为50岁)TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达。结果 40例肝硬变患者肝组织中TIMP-1利TIMP-2 mRNA表达的阳性率为100％,TIMP-1 mRNA的表达强阳性40例中有32例,占80％,中等阳性6例,占15％.弱阳性2例,占5％;TIMP-2 mRNA的表达强阳性40例中有22例。占55％,中等阳性16例,占40％,弱阳性2例,占5％TIMP-1 mRNA阳性的肝组织中TIMP-2 mRNA亦为阳性,且TIMP-1 mRNA表达强度略高于TIMP-2 mRNA。而正常肝组织中未见阳性表达。TIMP-1利TIMP-2 mRNA表达的阳性信号主要位于肝细胞胞质中,未见细胞核表达。结论肝硬变患者肝组织中的肝细胞中存在TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达,TIMP-1和TIMP-2可能与肝病的进展相关,它通过抑制MMPs的活性,使得ECM降解减少而导致肝纤维化,以至肝硬变。

HCV感染后机体保护性免疫缺陷原因探讨

目的探讨丙型肝炎患者保护性免疫缺陷的原因。方法根据HCVC区和NS4区基因序列设计并人工合成3条合成肽,采用抗原捕捉酶联免疫吸附试验检测HCV感染者血清中抗-HCV IgG抗体轻链κ/λ比值,同时以正常人血清做对照。结果抗-HCV SP42,CP10和CP9抗体轻链的表达呈明显的偏斜;116例抗-HCV阳性者中113例(97.41％),抗-HCV IgG抗体轻链κ/λ比值偏高,所有病例追踪观察1a(其中11例抗-HCV阳性者随访2a);30例患者接受α-干扰素治疗,发现抗-HCV抗体κ/λ比值恒定不变。结论 HCV感染者抗-HCV抗体的产生不均匀性并呈稳定的克隆性。B细胞克隆优势化可能是HCV感染后机体保护性免疫缺陷的原因之一。

GB病毒B型(GBV-B)感染的临床与免疫病理研究

目的自从建立起甲、乙、丙、丁、戊5种肝炎病毒的病原学诊断之后,仍有少部分肝炎患者的病因得不到明确,因此不少学者试图探索是否还有新型肝炎病毒的存在,并进行了大量的流行病学和实验诊断的研究,认为的确存在可经肠道外传播并引起人类肝炎的致病因子.1995年 Simons et al 成功地克隆出2株黄病毒 RNA 序列,称之为 GBV-A,GBV-B.继而从一名西非患者血清中克隆出另一黄病毒 RNA 序列,称之为 GBV-C.1996年初美国另一研究小组从一名慢性输血后肝炎患者血清中克隆出一株黄病毒 RNA 序列,称之为 HGV.进一步的研究后认为 GBV-C,HGV 为同一病毒的不同分离株.动物实验发现,GBV-B 可单独引起动物发病,而 GBV-A 单独感染时未能引起发病.本文以此为依据,对 GBV-B 感染者的临床与免疫病理加以研究,试图探讨 GBV-B 对人体肝脏的致病性及其在人体内的分布状态.方法根据 GBV-B NS5区的核苷酸和氨基酸序列,通过计算机软件对其抗原位点进行了预测,并分析其亲水性、键流动性、电荷状态及抗原表位分布等特性,合成一条30个氨基酸多肽.探讨合成肽最佳包被量之后,成功地建立了间接 ELISA 法,用来检测抗-GBV-B.应用此方法检测各型肝炎及其他高危人群血清标本1286份.同时应用 RT-PCR 检测血清中 GBV-B RNA及免疫组化检测肝炎患者肝组织相关病毒抗原.结果经鉴定合成肽纯度在95%以上,氨基酸分析的实际值与理论值基本一致.将合成肽与牛血清清蛋白(BSA)偶联免疫白兔获得高效价抗-GBV-B NS5区的多克隆抗体(PcAb).批内、批间变异系数分别为6.06%和7.65%(均<10%);中和抑制试验结果证明我们建立的 ELISA 法具有较好的特异性.血清抗-GBV-B 检测结果表明各型肝炎患者血清抗-GBV-B 阳性率为10.56%;其中非甲～非戊型肝炎患者血清抗体阳性率为8.57%;肝炎高危人群如献血员、血液透析者及静脉药瘾者血清抗-GBV-B 阳性率分别为2.90%,8.62%及13.44%.随机抽取抗-GBV-B 阳性和抗-GBV-B 阴性血清标本各32例进行RT-PCR 检测 GBV-B RNA,结果64例均为阴性.应用抗-GBV-B 多克隆抗体为试剂,对42例肝炎患者肝组织进行免疫组化研究,均未检测出 GBV-B 相关抗原.结论提示 GBV-B 可能不是人类肝炎病毒,对人体肝脏的致病性轻微,其抗体在不同人群中出现可能是一种短暂的感染,其意义有待进一步研究.

地高辛素标记探针原位杂交法检测肝组织中庚型肝炎病毒RNA

目的自从建立起甲、乙、丙、丁、戊5种肝炎病毒的病原学诊断之后,仍有少部分肝炎患者的病因得不到明确,因此不少学者试图探索是否还有新型肝炎病毒的存在,并进行了大量的流行病学和实验诊断的研究,认为的确存在可经肠道外传播并引起人类肝炎的致病因子.目前关于庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)的致病性和组织嗜性尚无结论性资料.本文目的是研究 HGV/GBV-C RNA 在肝组织中表达并进一步探讨HGV/GBV-C 引起肝脏损害的可能机制.方法应用地高辛素标记 HGV/GBV-C cDNA 探针原位杂交法检测肝组织中庚型肝炎病毒 RNA.结果检测196例肝炎患者肝组织切片中的 HGV/GBV-CRNA 阳性率为37.24%;在血清中 HGV/GBV-C RNA 呈阳性患者肝组织中该病毒 RNA 检出率为48.94%;单一 HGV/GBV-C 感染者肝组织中检出率为58.33%;阳性信号仅为胞质型.原位杂交信号阳性细胞与肝细胞变性、瘀胆、炎性细胞浸润及细胞坏死程度等并不相关.本文原位杂交与免疫组化两种检测方法对比研究结果表明,两项技术有较高的符合率(86.74%),说明这两项技术具有相辅相成的作用.结论提示 HGV/GBV-C RNA 并不直接损害肝细胞.原位杂交和免疫组化两项技术成功地应用于石蜡包埋切片,为回顾性研究 HGV/GBV-C 的致病性及致病机制提供了有价值的实验手段.

不同载体及靶基因对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响

目的 探讨不同DNA载体及靶基因对DNA疫苗免疫效果的影响。 方法 用已构建的不同载体HBV S基因疫苗(pCR3.1-S,pcDNA3-S)和HBVC基因疫苗(pCR3.1-C)分别给Balb/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫一次,用ELISA法及MTT法分别检测小鼠血清抗-HBs及抗HBc及脾细胞对HBsAg或HBcAg的特异性增殖反应。 结果 免疫接种2wk后小鼠血清抗-HBs及抗HBc抗体均明显高于对照组,载体pCR3.1的表达效力稍高于pcDNA3,但同一基因不同载体间无显著差异,不同靶基因血清抗体滴度及脾细胞对HBsAg或HBcAg的刺激指数均明显高于对照组,刺激指数pCR3.1-C组明显高于单纯pCR3.1-S注射组。 结论 两种载体均可以诱导较强的体液免疫应答;但同一基因不同载体间无显著差异,HBVS和C基因疫苗均可诱导较强的体液和细胞免疫应答强度;C基因以细胞免疫增高为主。

治疗慢性乙型肝炎新药-替诺福韦酯

替诺福韦酯(TDF)是一种新型的无环核苷(酸)类似物,于2001年被美国FDA批准治疗人免疫缺陷病毒(HIV)的感染.目前TDF已经是广泛使用的治疗HIV的核苷(酸)类逆转录酶抑制剂之一.替诺福韦酯在临床实践中的效果,良好的适用性和合适的剂量均使其成为一线治疗的最流行药物之一.已有临床研究显示,TDF对合并感染HIV及乙型肝炎病毒(HBV)的患者具有较好的疗效.本文主要对TDF的研发背景、作用机制、药理学特点、不良反应、在CHB相关疾病方面的临床应用以及在治疗CHB的费用效能分析等方面的研究作一简要述评.

胸腺肽α_1在慢性病毒性肝炎抗病毒治疗中的应用

胸腺肽α1是从胸腺素第5组分中分离纯化出的一种小分子生物活性多肽。近年来,胸腺肽α1开始用于慢性乙型病毒性肝炎和慢性丙型病毒性肝炎的治疗,其耐受性较好,可能成为一种较好的治疗药物。但是,由于胸腺肽α1治疗肝炎相关数据的缺乏,使得人们对其治疗作用及作用机制还不太明确。鉴于此,本文对胸腺肽α1在病毒性肝炎抗病毒治疗中的应用进行综述。

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎耐药性的基础与临床研究

拉米夫定(lamivudine)是核苷类似物,对乙型肝炎病毒(HBV)的复制有很好的抑制作用．其主要抗病毒机制是抑制HBV多聚酶的逆转录酶活性,有效阻止病毒核酸的复制合成．拉米夫定因其具有迅速抑制HBV复制,降低病毒载量,促进HBeAg血清转换,改善肝组织炎症坏死病变,延缓肝纤维化进程作用,以及良好的耐受性、安全性和服用方便等特点,已广泛应用于临床．虽然总体上不良反应发生率较低,但是在临床继续应用的几年后遇到了越来越多的治疗问题,尤其是拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的耐药性问题．现对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的作用机制、耐药性产生及发生机制、HBV产生耐药性的分子病毒学基础、YMDD变异株的生物学特性及YMDD变异对病情的影响等作了系统全面的阐述,并就预防和处理耐药性问题提出了应对策略,对拉米夫定联合用药等问题作了回顾与展望．

HGV/GBV-C与HCV混合感染者肝组织中相关病毒抗原表达

庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)的致病性是目前研究焦点之一,多数研究表明大多数HGV/GBV-C感染者体内常有两种或两种以上的肝炎病毒混合感染,并认为HGV/GBV-C感染对原有乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染的基础病变似无明显影响,但仅从血清学、临床表现及常规病理角度试图说明HGV/GBV-C对机体有无损害的研究工作是很困难,我们应用免疫组织化学技术对HGV/GBV-C与HCV混合感染者肝组织中HGV/GBV-C。HCV相关抗原表达进行研究,试图从免疫病理学角度探讨HGV/GBV-C对机体肝脏的致病性。 1

膳食钙对高血压大鼠血压的影响

目的:观察膳食钙对一氧化氮缺乏性高血压大鼠血压、血清一氧化氮浓度及一氧化氮合酶活性的影响。方法:实验于2005-10-22/2006-01-13在解放军第四军医大学动物实验室及形态学实验室进行。取雄性SD大鼠24只,随机区组等分成4组(n=6):①对照组:基础饲料喂养,40mg/(kg·d)去离子水灌胃,饲养期间饮去离子水。②高钙组:第3周开始给予5.0%的高钙膳食,40mg/(kg·d)去离子水灌胃,饲养期间饮去离子水。③L-NAME+高钙组:第3周始将40mg/(kg·d)左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)溶于去离子水中每天灌胃,第7周停止给予L-NAME,开始给予5.0%的高钙膳食,饲养期间饮去离子水。④L-NAME组:第3周始将40mg/(kg·d)L-NAME溶于去离子水中灌胃,基础饲料喂养,饮去离子水。每周应用RBP-1型大鼠血压仪测量血压,10周后处死所有大鼠,硝酸还原酶法检测血清中一氧化氮的浓度和一氧化氮合酶活性。结果:24只大鼠全部进入结果分析。①血压:从实验第4周开始L-NAME+高钙组和L-NAME组明显高于对照组和高钙组(P<0.01),从第7周到第10周实验结束时,L-NAME组血压明显高于其他3组(P<0.01)。②血清一氧化氮浓度:对照组低于高钙组和L-NAME+高钙组[(8.81±6.63),(14.80±5.32),(15.26±3.55)μmol/L,P<0.05],但高于L-NAME组[(2.89±1.71)μmol/L,P<0.05];高钙组和L-NAME+高钙组比较差异无显著性(P>0.05);L-NAME+高钙组则高于L-NAME组(P<0.05)。③血清一氧化氮合酶活性:对照组低于高钙组和L-NAME+高钙组[(334.57±74.35),(436.09±69.35),(448.76±45.68)μkat/L,P<0.05],但高于L-NAME组[(255.88±35.17)μkat/L,P<0.05];高钙组和L-NAME+高钙组比较差异不显著(P>0.05);L-NAME+高钙组则高于L-NAME组(P<0.05)。结论:①高钙膳食可以降低一氧化氮缺乏型高血压大鼠的血压,升高其血清一氧化氮浓度和一氧化氮合酶活性。②高钙膳食可以增加正常血压大鼠体内一氧化氮水平和一氧化氮合酶活性。

丙型肝炎病毒母婴感染研究及其预防现状

丙型肝炎病毒(HCV)感染在全世界估计约1亿7千万人,多数感染者呈慢性携带状态,且常进展为肝硬化和肝细胞癌.在我国一般人群感染率约3.2%.HCV经典的传播途径为经血液或血液制品传播.但1991年后,献血员HCV的筛检已使输血后丙型肝炎大为减少,HCV传播途径正在发生改变,儿童非输血、血液制品的丙型肝炎日渐增多.母婴间宫内、分娩时及产后感染已成为当前及今后研究的重要问题.现研究证实HCV可经胎盘引起胎儿感染,宫内感染是HCV传播的一条重要途径.而当前的研究多数为流行病学调查及分子生物学研究,关于HCV如何在母婴间进行传播的具体机制研究甚少.丙型肝炎在我国较常见,加之又无特效药物治疗,给国民健康带来了很大危害.目前,丙型肝炎疫苗研制受阻,难以用于人体预防,因此阻断HCV母婴传播的研究工作就显得十分重要.由此可见,研究并阐明HCV宫内传播的分子机制,针对性提出阻断方案是一项对国计民生均十分迫切而重要的课题.可以说,研究HCV的母婴感染以及如何防治HCV的母婴传播将是今后研究的重点.

HGV/GBV-C与HCV混合感染者外周血单个核细胞及肝脏中相关病毒负链RNA的检测意义

目的自从建立起甲、乙、丙、丁、戊5种肝炎病毒的病原学诊断之后,仍有少部分肝炎患者的病因得不到明确,因此不少学者试图探索是否还有新型肝炎病毒的存在,并进行了大量的流行病学和实验诊断的研究,认为的确存在可经肠道外传播并引起人类肝炎的致病因子,目前关于庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)的致病性和组织嗜性尚无结论性资料我们研究了HGV/GBV-C与HCV混合感染者PBMC和肝脏中HGV/GBV-C复制中间体(负链RNA)的存在状况。方法应用逆转录巢式PCR技术,检测了32例肝炎患者PBMC和肝脏中HGV/GBV-C和HCV正负链RNA。结果 26例HGV/GBV-C与HCV混合感染者PBMC和肝脏中均未检测到HGV/GBV-C负链RNA;而在9份PBMC和15份肝脏标本中检出HGV负链RNA。结论 HGV/GBV-C与HCV混合感染时,在PBMC和肝脏中尚未发现该病毒复制的征据,提示在肝炎病毒混合感染患者中,PBMC和肝脏可能不是HGV/GBV-C的复制场所。