DNER通过抑制线粒体自噬促进胃癌细胞恶性进展的机制研究

目的研究Delta/Notch样表皮生长因子相关受体(delta/notch-like epidermal growth factor-related receptor,DNER)在胃癌中的作用及其调节机制。方法通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测胃癌组织和细胞中DNER mRNA和蛋白表达水平。构建沉默DNER表达的胃癌细胞系SGC7901,用线粒体动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)抑制剂Mdivi-1处理细胞。CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞活力、侵袭能力和细胞凋亡。Western blot检测DNER蛋白、凋亡相关蛋白[半胱天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)]、自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-II/Ⅰ,LC3Ⅱ/Ⅰ)、p62,PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],以及线粒体裂变和融合蛋白[DRP1,线粒体分裂因子(mitochondrial fission factor,MFF)、线粒体分裂蛋白1(fission mitochondrial 1,FIS1)、视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)、线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)和MFN2]水平。结果胃癌肿瘤组织和细胞中DNER mRNA,蛋白表达水平分别显著高于相邻正常组织(t=-52.485,-46.955)和人正常胃上皮细胞(F=60.551,60.652),差异具有统计学意义(均P<0.001)。沉默DNER显著抑制SGC7901细胞的增殖和侵袭、诱导细胞凋亡、增加细胞凋亡相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=8.026~25.903,均P<0.05)。沉默DNER显著升高LC3Ⅱ/Ⅰ比率(t=18.086),降低p62蛋白水平(t=6.747),促进PINK1和Parkin蛋白在线粒体的聚集(t=15.630,18.171),抑制线粒体融合蛋白OPA1,MFN1和MFN2表达(t=12.835,8.963,9.732),促进线粒体裂变蛋白DRP1,MFF和FIS1表达(t=16.034,16.939,15.971),差异具有统计学意义(均P<0.05)。Mdivi-1处理可抵消沉默DNER对胃癌细胞线粒体自噬及细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结论DNER通过抑制线粒体动力学失衡减少线粒体自噬,促进细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,从而促进胃癌进展。

槐耳菌质对人胆管癌细胞侵袭与迁移的影响及其作用机制

背景与目的:胆管癌作为罕见的恶性肿瘤,难以诊断,往往在晚期才被发现,只能选择姑息疗法,但是常规的化疗药物对胆管癌治疗效果较差,急需寻找新的治疗药物。本研究探讨槐耳菌质对人胆管癌细胞恶性生物学行为的影响,及其与TGF-β/Smad通路的关系,旨在为槐耳菌质治疗胆管癌提供理论依据。方法:用不同浓度槐耳菌质孵育人正常肝细胞L-02和人胆管癌细胞HuCCT1不同时间后,检测细胞增殖情况,并计算半数抑制浓度(IC_(50));将HuCCT1细胞分为阴性对照组(无干预)、阳性对照组(15 mg/L顺铂)和不同浓度槐耳菌质干预组(根据浓度与时间为预实验结果选择1/5 IC_(50)、2/5 IC_(50)和IC_(50)),用划痕试验与Transwell实验检测细胞迁移与侵袭能力,同时用Western blot检测HuCCT1细胞中TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达。结果:只有较高浓度的槐耳菌质(>312.5 mg/L)对L-02细胞的增殖有明显抑制作用;当浓度超过5 mg/L时,槐耳菌质能明显抑制HuCCT1细胞增殖,且呈浓度依赖性(均P<0.05),IC_(50)分别为24 h:138.52 mg/L、48 h:99.41 mg/L、72 h:113.52 mg/L。与阴性对照组比较,阳性对照组与三种浓度(20、40、100 mg/L)的槐耳菌质干预组HuCCT1细胞迁移距离、侵袭细胞数减少,TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、N-cadherin、Snail和Slug表达降低,E-cadherin表达增加(均P<0.05);与阳性对照组比较,三个槐耳菌质干预组的上述变化更弱,但呈明显的浓度依赖性(均P<0.05)。结论:槐耳菌质可以抑制HuCCT1细胞恶性生物学行为,其作用机制可能与抑制TGF-β/Smad通路活性有关。