敲减MET表达对喉癌Hep-2细胞增殖、迁移及5-FU和顺铂敏感性的影响

目的:探究敲减间质表皮转化因子(MET)表达对人喉鳞状细胞癌(LSCC)Hep-2细胞生长、迁移及5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂敏感性的影响。方法:通过基因表达综合数据库(GEO)及癌症基因组图谱(TCGA)数据库数据分析人LSCC组织中MET mRNA的表达水平;常规培养正常人支气管上皮细胞16HBE与人LSCC细胞Hep-2、KBV200和TU212,采用qPCR法和WB法检测16HBE、Hep-2、KBV200和TU212细胞中MET基因和蛋白的表达水平。用LipofectamineTM3000将MET敲减质粒(si-Met)和对照质粒(si-NC)转染至Hep-2细胞中,分为空白对照组,si-NC组和si-Met组。采用MTT法、流式细胞术、划痕愈合实验分别检测各组Hep-2细胞的增殖、迁移能力、周期分布以及对5-FU和顺铂的敏感性。结果:数据库数据分析显示LSCC组织中MET mRNA呈高表达(P<0.05),Hep-2、KBV200和TU212细胞中MET mRNA和蛋白的表达水平也均明显高于16HBE细胞(均P<0.01)。敲减MET表达后,Hep-2细胞中METmRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.01或P<0.001)、细胞增殖活力显著下降(P<0.0001)、G0/G1期细胞数量明显升高(P<0.0001)、S期细胞数量明显降低(P<0.0001)。敲减MET表达后,不同浓度5-FU或顺铂对细胞增殖的抑制率均显著升高、药物半数抑制浓度(IC50)均降低(均P<0.0001),划痕愈合率明显降低、迁移能力下降(均P<0.05)。结论:MET在人LSCC组织和细胞中呈高表达,敲减MET可有效抑制Hep-2细胞中MET的表达,抑制细胞增殖、迁移能力,使其周期阻滞于G1期,增强Hep-2细胞对5-FU和顺铂的敏感性。

AMG-102通过调控c-Met/PI3K/Akt通路抑制喉鳞癌细胞增殖和诱导凋亡

目的探讨c-Met抑制剂AMG-102对喉鳞癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响及潜在机制。方法分别以2.5、5和10μmol/L的AMG-102处理喉鳞癌Hep-2细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测AMG-102对Hep-2细胞的增殖抑制作用,流式细胞术和Hoechst染色法检测细胞凋亡情况。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测凋亡相关基因的mRNA表达,Western blot检测c-Met/PI3K/Akt通路相关蛋白的表达。结果与对照组比较,2.5、5、10μmol/L AMG-102处理Hep-2细胞24 h的增殖率分别为(89.8±1.1)%、(79.8±1.0)%和(69.1±1.2)%,处理48 h的增殖率分别为(76.8±2.0)%、(60.2±1.1)%和(49.8±1.2)%,处理72 h的增殖率分别为(50.1±2.0)%、(41.5±1.1)%和(33.6±1.0)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。2.5、5、10μmol/L AMG-102处理Hep-2细胞48 h的凋亡率分别为(16.09±1.53)%、(27.51±2.02)%和(36.57±1.42)%,明显高于对照组[(3.62±0.10)%],差异均有统计学意义(均P<0.05)。2.5、5、10μmol/L AMG-102处理48 h,Hep-2细胞Bcl-2 mRNA的相对表达量分别为0.58±0.13、0.38±0.12和0.20±0.13,p-Met蛋白的相对表达量分别为80.0±3.8、50.6±4.2和28.5±1.3,p-PI3K蛋白的相对表达量分别为87.1±0.9、54.2±1.2和21.0±1.2,p-AKT蛋白的相对表达量分别为98.7±5.6、56.9±3.2和32.2±4.3,均明显低于对照组(均P<0.05);Bax mRNA的相对表达量分别为1.78±0.13、2.37±0.14和3.05±0.13,caspase-3 mRNA的相对表达量分别为1.98±0.14、2.47±0.14和3.15±0.13,均明显高于对照组(均P<0.05)。结论c-Met抑制剂AMG-102通过调控c-Met/PI3K/Akt通路,可以抑制喉鳞癌Hep-2细胞增殖,诱导其凋亡。

c-Met抑制剂AMG-102增强喉鳞癌细胞放射敏感性的机制

目的探讨c-Met抑制剂AMG-102对喉鳞癌细胞的增殖抑制和放射增敏作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测AMG-102对喉鳞癌细胞株Hep-2和KBV200的增殖抑制作用。采用克隆形成实验分析AMG-102对Hep-2和KBV200细胞的放射增敏作用。采用流式细胞术检测Hep-2和KBV200细胞的凋亡情况。采用Western blot法检测细胞中c-Met/p-Met、凋亡蛋白cleaved caspase 3及下游信号通路蛋白Akt/p-Akt和Erk/p-Erk的表达。利用RNA干扰技术下调细胞中c-Met表达,转染c-Met过表达质粒使细胞中c-Met过表达,分析Hep-2和KBV200细胞对AMG-102的敏感性变化。结果与KBV200细胞比较,Hep-2细胞对AMG-102更加敏感,半数抑制浓度(IC50)分别为14和9μmol/L。Hep-2细胞中c-Met和p-Met蛋白的相对表达量分别为194.48±0.57和177.76±1.53,均明显高于KBV200细胞(分别为171.24±1.00和115.37±0.56,均P<0.001)。AMG-102作用于肝细胞生长因子(HGF)处理后的KBV200细胞,可使其p-Met蛋白的相对表达水平明显降低(P<0.001)。与二甲基亚砜(DMSO)组比较,AMG-102联合照射可明显增加Hep-2细胞的放射敏感性(SER=1.28,P<0.001);而AMG-102对KBV200细胞的放射敏感性影响很小(SER=1.18,P=0.002)。与4 Gy照射组和5μmol/L AMG-102处理组比较,4 Gy照射+5μmol/L AMG-102处理组Hep-2细胞的凋亡率明显增加,cleaved caspase-3蛋白的表达水平明显升高。而各处理组KBV200细胞的凋亡率和cleaved caspase-3蛋白的表达水平无明显变化。与DMSO处理组比较,4 Gy照射组、5μmol/L AMG-102处理组和4 Gy照射+5μmol/L AMG-102处理组Hep-2细胞中p-Met、p-Akt和p-Erk蛋白的表达水平下降,其中4 Gy照射+5μmol/L AMG-102处理组中p-Met、p-Akt和p-Erk蛋白的表达水平比4 Gy照射组和5μmol/L AMG-102处理组更低。但在KBV200细胞中,各处理组的p-Met、p-Akt和p-Erk蛋白表达水平均未明显降低。照射前及照射后30 min、1 h、4 h、8 h、24 h Hep-2细胞中p-Met蛋白的相对表达水平分别为99.89±0.61、138.62±1.00、163.07±5.00、87.80±1.85、90.67±0.65和94.09±1.41,照射后30 min和1 h,p-Met蛋白表达水平有所增加(均P<0.001),但照射后4~24 h,p-Met蛋白表达水平明显下降(均P<0.05),而KBV200细胞中p-Met蛋白的表达水平不随照射时间的变化而变化(P>0.05)。干扰c-Met蛋白表达后,Hep-2细胞对AMG-102的敏感性下降,而KBV200细胞对AMG-102的敏感性无明显变化(P>0.05)。进一步检测显示,与siRNA阴性对照组比较,c-Met-siRNA组Hep-2细胞的放射敏感性呈增加趋势(SER=1.07,P=0.068)。质粒诱导c-Met过表达后的两种细胞经10μmol/L AMG-102处理,KBV200细胞的增殖率为(60.05±3.23)%,明显低于空白对照组和siRNA阴性对照组[分别为(90.08±1.04)%和(90.12±1.01)%,P<0.001],提示过表达c-Met蛋白后,KBV200细胞对AMG-102的敏感性升高,而Hep-2细胞对AMG-102的敏感性下降。进一步检测显示,c-Met过表达的KBV200细胞的放射敏感性呈下降趋势(SER=0.7,P=0.005)。结论c-Met抑制剂AMG-102对c-Met过表达的喉鳞癌细胞的增殖抑制作用明显、放射增敏作用强,表明具有c-Met过表达的喉鳞癌应用抗c-Met受体的分子靶向治疗更有效。

RNA干扰沉默c-Met对喉鳞癌细胞生物学行为影响

目的近年来细胞间质上皮转换因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-Met)基因在恶性肿瘤的防治研究中越来越受到关注,本研究旨在探讨c-Met基因对喉鳞癌细胞Hep-2增殖和迁移的影响。方法利用小干扰RNA技术构建低表达c-Met的喉癌细胞株Hep-2。实验分为siRNA干扰组、阴性对照组(转染阴性干扰片段)和空白对照组(细胞不做处理)。利用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerse chain reaction,qRT-PCR)检测喉鳞癌细胞Hep-2中c-Met表达含量;采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测c-Met基因对喉癌细胞增殖的影响;应用细胞划痕实验检测c-Met基因对喉癌细胞迁移能力的影响。采用SPSS 25.0对数据进行统计学分析,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两多重比较采用LSD法。结果 qRT-PCR检测结果显示,空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组Hep-2细胞中c-Met mRNA的相对表达量分别为1.00±0.00、0.94±0.05和0.42±0.03,3组c-Met mRNA表达均值差异有统计学意义,F=326.9,P<0.000 1;两两多重比较结果显示,空白对照组与阴性对照组之间差异无统计学意义,P=0.07。蛋白质印迹法检测结果显示,空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组Hep-2细胞中c-Met蛋白的相对表达量分别为100.00±0.00、117.04±10.56和61.98±15.95,3组c-Met蛋白表达均值差异有统计学意义,F=19.54,P=0.002 4;两两多重比较结果显示,空白对照组与阴性对照组之间差异无统计学意义,P=0.108。MTT法检测结果显示,转染24h后,空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组Hep-2细胞吸光度(A)值分别为0.620±0.010、0.600±0.011和0.440±0.046,3组Hep-2细胞A值均值差异有统计学意义,F=37.980,P=0.000 4;两两多重比较结果显示,空白对照组与阴性对照组之间差异无统计学意义,P=0.808 3。转染48h后,空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组Hep-2细胞A值分别为1.083±0.038、1.040±0.010和0.643±0.061,3组Hep-2细胞A值均值差异有统计学意义,F=100.500,P<0.000 1;两两多重比较结果显示,空白对照组与阴性对照组之间差异无统计学意义,P=0.425 6。细胞划痕实验结果显示,空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组Hep-2细胞划痕修复率分别为(53.381±2.616)%、(54.223±1.935)%和(13.542±0.104)%,3组细胞划痕修复率均值差异有统计学意义,F=458.9,P<0.000 1;两两多重比较结果显示,空白对照组与阴性对照组之间差异无统计学意义,P>0.999 9。结论下调c-Met基因表达能够引起喉鳞癌细胞生物学行为的改变,抑制细胞增殖及细胞迁移,从而在一定程度上抑制肿瘤的发生、发展。