猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。

非洲猪瘟病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)快速、敏感的检测方法,根据GenBank中登录的中国流行株ASFV-SY18的P 72基因,建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对所建立方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,所建立的非洲猪瘟病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法能有效扩增1.0~1.0×109 copies·μL-1的ASFV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0 copies·μL-1;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数小于1%,重复性良好。

基于重组酶介导扩增技术诊断鸭瘟方法的建立

以具有种属特异性的鸭瘟病毒gC基因为靶基因,设计引物和荧光标记探针,使用重组酶介导扩增方法(Recombinase aid amplification assay,RAA),39℃恒温扩增,建立了检测鸭瘟病毒的普通和荧光RAA方法。该方法具有良好特异性,仅对鸭瘟病毒检测结果为阳性,而与番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、鸭源沙门菌、鸭源大肠杆菌O157无交叉反应。普通和荧光RAA方法的灵敏度分别为100 copies/μL和10 copies/μL,对28份留存的鸭瘟阳性组织样本和84份疑似鸭瘟临床样品检测结果表明建立的方法与商业化PCR试剂盒的符合率为100%。结果表明,RAA方法实现常温扩增、操作简单、费用低廉、无需热循环过程,是一项具有广泛前景的方法。

促进养蜂业发展助力脱贫攻坚战

养蜂业的发展从产品的来源、特性、效益来看都有着很明显的特色优势,养蜂业主要借助于大自然丰厚的资源,使用设备简单,生产方式灵活,流动性大,学习门槛低,是一项投资小、见效快、收益大的扶贫产业,同时也促进农作物增产,据统计,我国蜜蜂授粉促进农作物增产产值超过500亿元.养蜂业的初级产品众多,如蜂蜜、蜂王浆、蜂花粉、蜂蜡等,而且市场上精加工产品涉及面也很广,其保健功效越来越被人们认可.养蜂业也带动了一批蜂产品收购人员,他们与蜂农追赶花期,常年活跃在祖国各地,充分保障了蜂产品加工企业的原料供应.本文就养蜂业的发展现状、相关措施建议等方面论述,以推动养蜂业发展,为脱贫攻坚战提供助力.

基于原核表达鸭瘟病毒gC蛋白建立的表面等离子共振检测技术的研究

本研究旨在应用表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)建立鸭瘟血清的SPR检测方法。PCR扩增鸭瘟g C基因全长,亚克隆于原核表达载体pET32a中,诱导、表达、纯化鸭瘟g C蛋白,将其作为捕获蛋白偶联芯片,建立了鸭瘟的SPR检测方法。敏感性、特异性和实用性分析结果显示,该SPR方法仅与鸭瘟阳性血清有明显反应,而对鸭流感病毒、番鸭细小病毒、传染性喉气管炎病毒、小鹅瘟病毒、马立克病毒、鸭源沙门菌和鸭源大肠杆菌等血清为阴性反应;倍比稀释鸭瘟阳性血清,SPR的灵敏度可达0.1?g;对留存的19份疑似鸭瘟血清的SPR检测与商业化ELISA的检测结果完全一致。上述结果表明,本研究建立的表面等离子共振技术具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、样品免标记等特点,适用于鸭瘟血清的快速检测。