蜜环菌发酵液及其菌丝体的化学成分研究

蜜环菌(Armillaria mellea)是药用植物天麻(Gastrodia elata)营养生长阶段的共生真菌。为研究蜜环菌的化学成分和生物活性,本实验综合运用MCI树脂、正相硅胶、Sephadex LH-20凝胶及半制备RP-HPLC等色谱分离技术对蜜环菌发酵液及其菌丝体的95%乙醇提取物进行系统分离,得到26个化合物。根据化合物的理化性质和波谱数据,分别鉴定为十四烷酸(1)、α-亚麻酸(2)、油酸(3)、亚油酸(4)、亚油酸乙酯(5)、8(R),11(S)-二羟基-9 Z,12 Z-十八烷二烯酸(6)、2-油酰甘油(7)、1-亚油酸甘油酯(8)、二羟丙基-油酸(9)、亚油酸甲酯(10)、甘油1,3-二亚油酸酯(11)、(5 Z,9 Z)-17-甲基-非十七烯酸-5,9-二酯(12)、(2 S)-α-(9′Z,12′Z,15′Z)-十八碳三烯酸(13)、麦角甾醇(14)、(22 E,24 S)-5α,8α-环二氧-6,22-麦角甾二烯-3β醇(15)、对羟基苄基乙基醚(16)、尿嘧啶(17)、环D-脯氨酸-D-异亮氨酸(18)、环D-脯氨酸-D-亮氨酸(19)、环D-脯氨酸-D-苯丙氨酸(20)、脯氨酸(21)、环D-脯氨酸-L-缬氨酸(22)、环D-脯氨酸-D-缬氨酸(23)、4-(2-羟乙基)-5-甲基噁唑(24)、环丙氨酸-缬氨酸(25)、环丙氨酸-脯氨酸(26)。其中,化合物5~13、16和18~26是首次从蜜环菌中分离获得。体外生物活性研究表明化合物14和15对LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应具有抑制作用。

鲜天麻采后生理品质变化规律及病原菌鉴定的研究

以大方乌天麻为试材,测定其17个生理品质指标(硬度、呼吸强度、含水量、色差外、色差内、可溶性固形物、蛋白质、多糖、天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、SOD、PPO、POD、CAT、APX)的变化规律,鉴定了天麻贮藏期的病原菌,并对各项生理品质指标进行相关性分析和主成分分析。结果表明:在贮藏期30 d时,低温(1±0.5)℃贮藏天麻的多糖、天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛分别为241.36 mg·g^-1,632.46、76.48、186.82、6.07μg·g^-1,而常温(25±0.5)℃贮藏天麻的多糖、天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛分别为225.28 mg·g^-1,603.32、71.32、173.32、5.32μg·g^-1。所以,低温(1±0.5)℃能够延缓鲜天麻采后的生理品质变化,建议天麻冷藏温度为0~1℃,天麻呼吸类型为跃变型呼吸。天麻贮藏期主要的病原菌为新壳梭孢菌(Neofusicoccum sp.)、间座壳属(Diaporthe sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)和镰刀菌属(Fusarium sp.)。相关性分析表明,鲜天麻采后生理品质均呈现良好的相关性,并且天麻的营养指标(天麻素、腺苷、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛)相互之间均呈现极显著正相关(P<0.01)。另外,通过主成分分析建立了天麻17个生理品质的综合评价函数,用于对天麻贮藏品质变化进行评价。

冬竹荪多糖及氨基酸含量的测定与分析

为进一步开发利用冬竹荪,采用显色比色法、柱前衍生化-HPLC法测定冬竹荪中多糖和氨基酸的含量,并用氨基酸比值系数法评价其蛋白质营养价值。结果表明:冬竹荪中多糖含量为10.82%,冬竹荪的17种氨基酸中包含了8种必需氨基酸,氨基酸总量为8.72%,必需氨基酸总量为3.59%;必需氨基酸与氨基酸总量的百分比(E/T)为40.4%、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(E/N)为0.68;第一限制性氨基酸为蛋氨酸+胱氨酸,氨基酸比值系数分(SRC)为70.61。冬竹荪具有较高的营养价值,是一种极具市场和开发价值的食药两用真菌。

乌蒙山区小菇属萌发菌的分离鉴定及其菌种生产优化

目的:分离鉴定小菇属菌,扩展萌发菌种质资源和优化萌发菌培养条件,为天麻萌发菌菌种的生产提供资料和指导。方法:采用米麻组织块分离法和转接纯化培养技术进行菌株的分离纯化,运用传统形态学、显微技术对分离菌株的菌落、菌丝、孢子等形态特征进行鉴定,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增rDNA(Ribosomal DNA)内转录间隔区(ITS)进行测序分析,进一步与美国国家生物信息中心(NCBI)数据库进行同源性检索比对,利用MEGA6软件采用最大似然法(Maximum Likelihood,M-L)构建系统进化树,对分离菌株进行分类鉴定;同时,采用正交试验优化萌发菌生长条件。结果:分离获得86株菌株,分别属于12个属的21个物种,其中WMMFJ,SHXG,WMM-21和MFJ8103菌株鉴定为Mycena purpureofusca,ZT01-6和ZT01-8菌株鉴定为M.cf.purpureofusca。萌发菌在麦麸培养基上的生长速率显著快于PDA培养基,且萌发菌生长的最佳培养基组成为土豆100 g,麦麸150 g,玉米粉100 g,葡萄糖20 g;间苯三酚的2种浓度对WMMFJ菌株有显著促进生长作用,对WMM-21和ZT01-6菌株有促进作用;2-甲氧基酚的2种浓度对WMMFJ菌株也具有促进作用。结论:新分离鉴定6株萌发菌菌种,其中4株为M.purpureofusca,2株为M.cf.Purpureofusca,采用的分离方法提高了萌发菌菌株的分离效果。

不同采收期乌天麻中多糖的提取及含量测定

采用水提醇沉法制备天麻多糖,在单因素试验基础上,考察提取时间、提取温度、液固比对天麻多糖提取工艺的影响,通过Box-Behnken法优化天麻多糖的提取工艺参数,确定最佳提取工艺条件为:液固比34∶1(mL/g)、提取温度77℃、提取时间78 min,在此提取条件下,天麻多糖的得率为31.14%。通过对贵州省大方县不同采收期(立冬、冬至、立春)乌天麻中的多糖含量进行测定,结果显示不同采收期乌天麻中多糖的得率差异显著,其中冬至采收的乌天麻中多糖得率最高,最高可达32.2%,但不同采收期乌天麻中的多糖得率均大于20%,表明在这一段时间内采收均能保证天麻质量。

不同保鲜剂处理对鲜天麻贮藏品质的影响

为探究不同保鲜剂处理对天麻保鲜的影响,以乌天麻为试材,采后对乌天麻生理指标、营养指标及相关酶活性测定,研究不同保鲜剂处理(二氧化氯、咪鲜胺和乙醇)在冷藏条件下(1±0.5)℃对天麻贮藏品质的影响。结果表明:与对照比较,3种处理均能够抑制果实的腐烂率上升,延缓天麻硬度、可溶性固形物、天麻素、腺苷、对羟基苯甲醛和对羟基苯甲醇的下降,降低天麻的呼吸强度,保持更好地多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbic acid peroxidase,APX)活性,但乙醇加快了天麻多糖含量的下降,而二氧化氯(ClO2)和咪鲜胺均延缓了多糖含量的下降。综合比较,采后用二氧化氯(ClO2)浸泡对天麻的贮藏效果最好,能够显著延缓天麻的衰老进程,保持较高的贮藏品质。

不同预冻方式结合冷冻贮藏对天麻品质的影响

以贵州乌天麻为试材,研究3种不同预冻处理(液氮速冻后转移至-18℃冷冻保存、-80℃预冻24h后转移至-18℃冷冻保存、-18℃冷冻保存)和-4℃微冻保存对鲜天麻品质的影响。研究结果表明,-80℃预冻24h后转移至-18℃冷冻保存效果最佳,在贮藏过程中始终保持饱满、质硬,腐烂率低,可溶性固形物及含水量稳定,天麻外部和内部的颜色变化小,咀嚼性好等特性,可延长天麻贮藏期至210d。

两种食品添加剂对鲜天麻采后真菌多样性的影响

食品添加剂在农产品采后病害的防治已得到广泛的应用。本研究以鲜天麻低温贮藏、室温货架腐烂情况为基础,通过Illumina NovaSeq高通量测序技术探究了脱氢乙酸钠、香芹酚及纯水处理对鲜天麻表皮真菌多样性变化的影响情况。结果表明,较直接采挖的带土新鲜乌天麻(CK组),脱氢乙酸钠和香芹酚处理能够有效地延缓鲜天麻在整个贮藏和货架期间的腐烂,而纯水处理在短期低温贮藏可以延缓鲜天麻的腐烂。与CK组相比,脱氢乙酸钠处理、香芹酚处理和纯水处理能够降低真菌多样性和丰富度,其中脱氢乙酸钠处理组真菌多样性和丰富度最低,其次为香芹酚处理组。引起CK组腐烂的主要致腐菌为镰刀菌属Fusarium、土赤壳属Ilyonectria和青霉属Penicillium的种类。通过高通量测序可知,与CK组相比,脱氢乙酸钠和香芹酚处理能够降低病原菌镰刀菌属、青霉属和土赤壳属的相对丰富度,且脱氢乙酸钠对青霉属有较强的抑制作用,香芹酚对镰刀菌属和土赤壳属抑制作用较强。研究结果表明,脱氢乙酸钠和香芹酚处理能够较大程度导致鲜天麻表皮真菌群落发生变化,抑制天麻腐烂。

蜜环菌和冬荪菌侵染与降解菌材的比较研究

天麻菌材浪费的现象十分普遍,实践证明种植过天麻的旧菌材用于种植冬荪可取得较好的效益,但其机制还不清楚。该研究通过对天麻旧菌材及冬荪旧菌材的形态学解剖,比较蜜环菌和冬荪菌对菌材侵染能力的差异;采用硝酸-95%乙醇法、硫酸法、四溴化法分别测定蜜环菌、冬荪菌对菌材中纤维素、木质素和半纤维素的消耗量,比较两者在菌材成分消耗上的差异,以探讨蜜环菌、冬荪菌循环利用菌材的机制,为天麻旧菌材循环利用提供科学依据。结果表明,蜜环菌对菌材维管形成层以外的部分入侵能力较强,而对维管形成层以内的部分入侵能力较弱;冬荪菌对2部分组织的侵染能力都较强;在菌材维管形成层以外的部分,蜜环菌对木质素及纤维素消耗量较大,冬荪菌对半纤维素消耗量较大;在菌材维管形成层以内的部分,蜜环菌对纤维素消耗量较大,冬荪菌对半纤维素消耗量较大。上述结果提示,蜜环菌和冬荪菌通过差异性地利用菌材中的不同成分来吸收碳源,以实现冬荪菌对天麻旧菌材的循环利用,蜜环菌以利用木质素、纤维素为主的碳源,冬荪菌则以利用半纤维素为主的碳源。

天麻种植旧菌材的资源再利用探索

解决种植天麻产生旧菌材的资源浪费问题。该研究基于生产实际,进一步探索了冬荪菌循环利用天麻旧菌材的机制,并考察了蜜环菌分泌物对冬荪菌及6种大宗食用真菌的化感作用,测定降解天麻旧菌材相关酶的活性,以筛选适应性较广的食用真菌。研究发现,冬荪菌能有效降解天麻旧菌材中的纤维素、半纤维素和木质素;蜜环菌的纤维素酶活力显著高于冬荪菌,冬荪菌的木质素过氧化物酶、多酚氧化酶和木聚糖酶活力显著高于蜜环菌,是蜜环菌和冬荪菌利用菌材中不同部位和成分来吸收碳源、形成生态位差异的重要原因。但是,在天麻旧菌材屑上,冬荪菌的生长速度明显受到抑制;蜜环菌的分泌物对冬荪菌及其他食用菌有化感作用,并且这种化感作用与化感物质的浓度有关;通过筛选,发现30%以下的蜜环菌液对香菇和木耳的生长发育影响不明显,表明对蜜环菌的化感作用具有较高抗性;分析发现这2种食用菌中的胞外木质素过氧化物酶、多酚氧化酶和木聚糖酶活力与冬荪菌相当,纤维素酶活力高于冬荪菌。该实验可以更进一步进行小范围的生产试验验证。

天麻褐腐病与土壤微生物菌群结构的关联分析

目的:研究褐腐天麻与土壤微生物菌群的组成及变化,阐述天麻种植过程中天麻褐腐病与土壤微生物菌群之间的关系,为揭示天麻褐腐病的原因提供理论基础。方法:采用内转录间隔区(ITS)和16S rDNA高通量测序技术,分别对健康、褐腐天麻及其周际土壤中真菌和细菌的微生物多样性、群落组成结构、群落结构相似性进行分析。结果:与健康组相比,褐腐天麻及其土壤中真菌和细菌分类单元(OTUs)数目均有增加,且土壤中真菌、细菌丰富度和多样性显著增高,褐腐天麻真菌多样性显著降低,细菌多样性显著增高。在属分类水平上,健康天麻及其周际土壤中的优势真菌属为被孢霉属Mortierella,该属在褐腐天麻及其土壤中分别减少7.62%和15.75%,优势细菌属为慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和Burkholderia-Paraburkholderia;褐腐天麻及其周际土壤中的优势真菌属为土赤壳属Ilyonectria,优势细菌属分别为沙雷氏菌属Serratia和慢生根瘤菌属Bradyrhizobium。结论:褐腐天麻与其周际土壤中真菌菌群具有极高相似度,说明土壤微生物真菌群落变化在一定程度上造成天麻褐腐病的发生,其中褐腐天麻真菌群落组成中致病真菌土赤壳属Ilyonectria成为优势菌属,推测该菌属可能含有天麻褐腐病的致病菌。

高温胁迫对蜜环菌生长特性的影响

目的探究高温胁迫对不同蜜环菌生长特性的影响,为筛选耐高温的优良蜜环菌菌株提供指导。方法以14株不同天麻产区的蜜环菌为实验材料,观察各蜜环菌菌株的生长特性并进行表型分类;采用rDNA-IGS序列分析进行分子鉴定,进一步确定供试菌株的亲缘关系;以23℃条件为对照(CK),30℃为高温胁迫,记录各菌株生长速度,生物量,菌索长度等指标。结果14株蜜环菌均与高卢蜜环菌Armillaria gallica相似性最高,亲缘关系最相近;但不同天麻产区的蜜环菌菌株生长特性存在明显差异,将14株蜜环菌分为Ⅳ个类群,其中生长状态:第Ⅰ类群>第Ⅱ类群>第Ⅲ类群>第Ⅳ类群;高温胁迫后,各菌株对高温的耐受性也存在明显差异,表现在菌索平均生长速度GZ16>SX1>GZ1;相对菌索长度GZ16>SX1>GZ3;相对生物量GZ16>SX4>GZ1>HB1>AH2;生长状态GZ16>SX1>GZ1。结论高温胁迫下,GZ16在生长速度,相对菌索长度,相对生物量及生长状态等均最优,SX1,GZ1菌株次之。表明菌株GZ16,SX1,GZ1耐高温能力较强,且这3个菌株在正常温度下生长特性也优良,适宜全国主要天麻产区生产。

冬荪新品种‘黔密1号’

冬荪新品种‘黔密1号’是从贵州省毕节市大方县羊场镇采集到的野生冬荪菌株中选育出的。子实体单生或丛生,子实体菌盖倒钟型,盖孔密度较密,菌柄白色,肉质致密,菌柄直径最宽处层数为4层。适宜在贵州和气候相似地区栽培。在贵州大方县栽培,其干品产量可达281.2 g·m^(-2)。

天麻种植生产的生态循环利用模式分析

天麻作为一种传统名贵中药,在人工栽培中尚未摆脱对森林资源的依赖。为了维持生态系统的平衡,尽可能减少资源浪费,该文通过实地调研,梳理了"林-麻"配套种植、"麻-菌"轮作、"林-麻-菌"立体种植、"因材施种"的菌材分类种植等循环利用模式,阐明了这些模式在天麻生产种所解决的生态问题,并分析其不足;最后,在现存模式的基础上,总结了一套完整的天麻生态种植体系,该种植体系强调:①在种植天麻前规划后续林,采用速生林与经济林相结合的方法,以速生林作为菌材的主要来源,并在经济林下种植天麻;②将菌材分级分类利用,叶片用于培养天麻萌发菌,小树枝用于培养原球茎及米麻,大树枝用于培养种麻,树干用于栽培商品麻;③循环利用天麻旧菌材,将旧菌材用于生产菌种或栽培栽培冬荪、竹荪、猪苓等食药用菌。该方案解决了菌材的来源、菌材及土地资源的高效利用等问题,丰富了产业结构,用有限的时间及土地资源获取更大的经济收益,无论是对于扶贫攻坚还是改善生态都有一定的指导意义。

天麻-冬荪轮种模式的生态效益研究

天麻是一种特殊的异养型药用植物,在栽培天麻的过程中,受连作障碍等因素的影响,种过天麻的菌材及土地常被废弃,造成了资源的极大浪费。该文结合天麻、冬荪的种植特点和前人在生态农业相关研究的经验,分析了天麻、冬荪的生态适应性特征,归纳了天麻-冬荪轮种的技术要点;持续对天麻-冬荪轮种模式的推广面积、菌材消耗量、市场销售情况等问题进行跟踪调查,从菌材利用率、单位面积土地资源的附加值、生态环境保护、劳动成本及经济效益等方面对天麻-冬荪轮种模式的生态效益进行分析,并根据天麻和冬荪的生态习性、收种时令、消耗菌材成分的差异性、微生物生态等方面阐明天麻-冬荪轮种的技术原理。天麻-冬荪的轮种既实现了药材和食用菌的双产,减少旧菌材的资源浪费,也使能量从营养供给型真菌向食药用型真菌的转换,保障了天麻种植过程中的生态循环利用。

天麻种植对土壤微生物群落结构的影响分析

目的分析不同生境种植天麻前后土壤微生物的群落结构变化,探讨土壤微生物对种植天麻的响应程度。方法对贵州大方和安徽金寨未种植天麻土壤(CK1和CK2),采收前天麻块茎周围土壤(GE1和GE2)和蜜环菌菌索周围土壤(AGE1和AGE2)进行ITS和16S rDNA测序分析。结果PCA主成分分析说明与对照土壤相比,种植天麻后土壤微生物发生较大改变。测序结果分析发现种植天麻使得土壤中真菌和细菌OTUs数目均有一定的增加。与对照土壤相比,贵州大方种植天麻后的土壤真菌和细菌群落的多样性及丰度均呈增加的趋势;安徽金寨种植天麻后的土壤真菌的多样性及丰度变化不大,土壤细菌群落丰度增加。二者土壤中土赤壳属Ilyonectria,硝化螺菌属Nitrospira的相对丰度显著升高,红菇属Russula的相对丰度显著降低;贵州大方土壤中镰刀菌属Fusarium,被孢霉属Mortierella的相对丰度显著增加。结论种植天麻后土壤微生物平衡被打破,并且土赤壳属Ilyonectria,镰刀菌属Fusarium等病原微生物丰度增加,推测与天麻病虫害有一定的相关性。

乌天麻的病害调查及其鉴定分析

真菌性病害是限制乌天麻产业健康发展的一个重要因素,乌天麻真菌性病害防治是当前天麻生产上极为关注的问题。该研究通过调查统计贵州大方以及云南小草坝主要乌天麻种植基地的乌天麻绝收率、烂窖率及乌天麻病害发生率,对我国当前的乌天麻病害情况做了详细的调研,结果发现乌天麻病害部位主要是从麻体顶芽、箭麻与母麻连接处开始侵染,造成乌天麻病害发生率达到6%~17%,产量下降率达10%~30%;从18个较典型的病害乌天麻样本中分离出23株优势真菌,通过对这23株优势真菌进行菌落形态、菌丝形态、孢子形态的观察以及遗传特征鉴定,最终鉴定将其确定为13个种,分属于5个门,7个属。其中真菌分离频率最高的是木霉属的哈茨木霉Trichoderma harzianum和土赤壳属的Ilyonectria sp.及I.destructans,分离频率分别达到22.22%,16.67%,16.67%。该研究首次从病害天麻中分离出土赤壳属的Ilyonectria sp.及I.destructans,可能是导致天麻土传病害的主要病原菌,而哈茨木霉T.harzianum作为天麻生防菌来防治病害具有一定潜能,可为乌天麻真菌性病害防控技术的研发提供理论依据。

不同采收期对天麻贮藏品质的影响

为探究不同采收期对天麻贮藏品质的影响,以乌天麻为试材,研究在天麻不同采收期间(采收期Ⅰ(2016/11/15)、采收期Ⅱ(2016/12/15)、采收期Ⅲ(2017/1/15)、采收期Ⅳ(2017/2/15))对其进行采收,在冷藏1±0.5℃条件下对天麻的保鲜效果。结果表明:适宜的采收期能够抑制天麻的生理代谢,延长天麻的贮藏期和维持更好的贮藏品质。过早采收的天麻营养物资积累少,贮藏后期衰老快;过晚采收的天麻成熟度高,呼吸强度旺盛,不耐贮藏,而采收期Ⅱ组和采收期Ⅲ组的天麻贮藏品质更好,能够降低天麻贮藏期的腐烂率,延缓天麻硬度、含水量、淀粉、多糖、天麻素和腺苷含量的下降,保持天麻更好的呼吸强度、PPO活性和POD活性。因此,天麻的适宜采收期为12月中旬至翌年1月中旬,并适合长期贮藏。