人β防御素3对绿色荧光蛋白标记水疱性口炎病毒复制的作用

目的探讨人β防御素-3(HBD3)对绿色荧光蛋白(GFP)-水疱性口炎病毒(VSV)病毒株复制的作用。方法取对数生长期非洲绿猴肾细胞(Vero)分为Control组、1.00感染复数(MOI)组、0.10 MOI及0.01MOI组,Control组为无病毒对照组,后3组Vero细胞用1.00 MOI、0.10 MOI、0.01MOI VSV-GFP感染,采用噬斑形成实验观察感染第3天时各组Vero细胞存活情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染24 h时1.00、0.10及0.01 MOI组Vero细胞内病毒基质蛋白(M)和GFP信使RNA(mRNA)表达;取对数生长期人非小细胞肺癌细胞(A549)分为未处理组、VSV-GFP组及VSV-GFP+HBD3组,采用Imag J软件对各组镜下A549荧光进行相对定量分析,使用RT-PCR检测各组A549细胞内M和GFP mRNA表达。结果随着病毒滴度的增加,Vero细胞内空斑形成数目增多;Vero细胞内M和GFP mRNA表达表现为0.01 MOI组<0.10 MOI组<1.00 MOI组(P<0.05);VSV-GFP+HBD3组A549细胞单位面积内的荧光强度较VSV-GFP组减弱(P<0.05),M和GFP mRNA表达较VSV-GFP组降低(P<0.05)。结论HBD3可抑制VSV-GFP进入细胞后的病毒复制。

人β防御素3和γ干扰素在MAPK信号通路中的相互诱导及联合抗甲型流感病毒的机制

目的 探讨人β防御素3(HBD3)和γ干扰素(IFN-γ)在丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中相互诱导作用及体外联合抗甲型流感病毒(IAV)H1N1的作用。方法 不同剂量IFN-γ(12.5、25.0、50.0、100.0μg/L)或HBD3(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)分别作用人支气管上皮细胞BEAS-2B 4、12、24、48 h,另设立p38 MAPK、ERK和JNK通路抑制剂预处理后、用IFN-γ(25.0μg/L)或HBD3(1.00 mg/L)处理BEAS-2B细胞4 h, qRT-PCR和ELISA检测HBD3及IFN-γ基因和蛋白表达,Western blot检测p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK蛋白表达;25.0μg/L IFN-γ、1.00 mg/L HBD3、HBD3 siRNA转染及IFN-γ中和抗体(0.50 mg/L)单独或联合作用BEAS-2B细胞、用5×TCID50H1N1感染,qRT-PCR和Western blot检测IAV核蛋白(NP)基因和蛋白的表达情况。结果 在BEAS-2B细胞中,不同剂量的IFN-γ与HBD3可互相诱导表达(P<0.05或P<0.01),且均可诱导p-p38 MAPK、p-ERK和p-JNK的表达上调(P<0.01);p38 MAPK、ERK和JNK通路抑制剂预处理,均明显下调IFN-γ诱导的HBD3表达、及HBD3诱导的IFN-γ表达(P<0.01);IFN-γ和HBD3单独或联合使用均可明显抑制BEAS-2B细胞中H1N1 NP的表达(P<0.05或P<0.01),转染HBD3 siRNA减弱了IFN-γ抑制H1N1 NP表达的作用(P<0.01),IFN-γ中和抗体介入对HBD3抑制H1N1 NP表达的作用无显著影响(P>0.05)。结论 在BEAS-2B细胞中,HBD3和IFN-γ可通过MAPK通路相互诱导表达,且2者联合使用可增强抗IAV H1N1的作用。

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测HPV16及HPV58方法的建立

目的将环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)联合应用,建立一种快速、可视化的HPV16、HPV58检测方法。方法运用LAMP在线引物设计软件,针对HPV16E6基因及HPV58L1基因保守区域设计引物及探针。采用生物素标记LF,荧光基团FAM和淬灭基团BHQ-1标记探针,LFD进行目视检测,建立HPV16和HPV58的LAMP-LFD检测方法,并对其特异性、灵敏度及临床实用性进行验证。将临床样品使用该方法的检测结果与实时LAMP扩增及qPCR结果相比较,计算符合率。结果优化的LAMP最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为50min。LFD检测仅需5min,故完成检测耗时仅55min;建立的LAMP-LFD方法能特异性检出HPV16、HPV58,其他5种常见高危型HPV呈阴性反应;该方法针对HPV16和HPV58的检测灵敏度均为100拷贝/μl,50份临床样品检测结果与实时LAMP和qPCR检测的符合率达100%。结论建立的HPV16、HPV58LAMP-LFD检测体系快速、简便,可视化。该方法对设备的要求低,仅需恒温孵育器即可完成,结果易观察,适用于现场HPV检测,以及经济落后和资源匮乏地区的HPV筛查。

基于实时荧光环介导等温扩增的HPV16及HPV18检测体系的建立

目的建立用于人乳头瘤病毒HPV16及HPV18快速检测的实时荧光环介导等温扩增技术。方法运用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V5,针对HPV16、18基因保守序列设计扩增引物,在反应前加入核酸染料SYBR GreenⅠ并对LAMP反应体系中内引物、Mg2+、dNTPs进行优化,优化结果通过实时荧光扩增曲线确定;然后对优化的HPV16、18 LAMP反应体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测。结果建立的实时荧光环介导等温扩增体系检测HPV16及HPV18的特异性为100%,与qPCR方法的符合率为100%。该体系检测HPV16及HPV18质粒的灵敏度为10拷贝/μl。结论建立的实时荧光环介导等温扩增体系检测HPV16、18简便、快速,灵敏度高,可用于HPV感染的早期筛查。

单核细胞HLA-DR百分比与单核细胞绝对计数联合应用对脓毒症预后的评估价值

目的探讨外周血单核细胞人类白细胞抗原-DR(mHLA-DR)百分比联合单核细胞绝对计数(AMC)与脓毒症患者预后的相关性及其预测价值。方法选择2019年9月-2020年9月贵州医科大学附属医院收治的脓毒症患者33例,并根据28 d预后情况将其分为幸存组25例和非幸存组8例。记录患者一般资料、急性生理与慢性健康状况评估(APACHEⅡ)评分和序贯器官衰竭评估(SOFA)评分。比较两组患者外周血降钙素原(PCT)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、单核细胞绝对计数(AMC)和mHLA-DR表达水平的差异,采用单因素及多因素Logistic回归分析法分析脓毒症患者预后的危险因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,评估不同指标对脓毒症患者的预后价值。结果非幸存组患者外周血PCT值6.04(1.03-20.16)ng/ml和NLR值13.69(7.86-24.21)均显著高于幸存组[2.18(0.54-9.50)ng/ml和和9.32(4.58-16.16)](P<0.05),而AMC(0.57±0.44)×10^(9)/L和mHLA-DR(52.54±19.40)%的水平均显著低于幸存组[(0.79±0.51)×10^(9)/L和(74.82±17.00)%](P<0.05);单因素及多因素Logistic回归分析结果显示,mHLA-DR是影响脓毒症患者28 d死亡的独立危险因素(OR=0.945,95%CI为0.922-0.969,P<0.01);ROC曲线分析结果显示,mHLA-DR预测脓毒症死亡的曲线下面积为0.814,最佳截断值为77.2%,敏感度为58.8%,特异性为96.7%,是脓毒症死亡的最佳预测因子,且当其与AMC联合应用时,曲线下面积为0.820,敏感度为96.7%,特异性为54.1%,显示出更高的评估价值。结论外周血PCT、NLR、AMC和mHLA-DR在不同预后的脓毒症患者中存在显著差异,mHLA-DR与AMC联合应用能提高脓毒症患者死亡的评估价值,可为临床提供参考。

防气溶胶污染的UDG-LAMP-LFD核酸检测体系的建立

目的 建立一种基于热敏UDG酶防污染的、环介导等温扩增(LAMP)技术及横向流动试纸条(LFD)联合使用的核酸检测方法,实现对HPV18的快速、可视化检测。方法 使用LAMP在线引物设计软件设计HPV18特异性引物,同时引入热敏UDG酶,建立UDG-LAMP检测体系,优化T/U碱基比例,设置对照试验验证热敏UDG酶防污染能力;根据LFD要求,设计特异性同化探针及淬灭探针,建立UDG-LAMP-LFD核酸检测体系并对LAMP反应时间进行优化;对该体系进行灵敏度、特异性及临床样品的验证,并与QPCR结果进行比较。结果 优化的LAMP反应时间为40 min, T/U比例为1∶1;热敏UDG酶孵育时间为10 min,防污染效果显著;LFD结果判读耗时5 min,整个检测时间为55 min。该UDG-LAMP-LFD核酸检测体系在以HPV18作为检测对象时,灵敏度10^(3)拷贝/μl;29例临床样品的验证结果与QPCR检测结果完全一致。结论 建立的UDG-LAMP-LFD检测体系可快速、特异、灵敏、可视化的检测HPV18,同时可避免气溶胶污染导致的假阳性。该方法对实验设备及工作人员要求较低,适合在偏远地区及基层医院使用。

肝素酶在人β-防御素-3抗甲型流感病毒的作用研究

目的探讨肝素酶在人β-防御素-3(Humanβ-defensin 3,HBD3)抗甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)中的作用。方法采用CCK8法检测肝素酶对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性情况;经肝素酶处理BEAS-2B细胞,并在4℃下与HBD3和IAV病毒液孵育2 h,分为未处理组(HBD3+IAV),肝素酶+HBD3+IAV组,提取细胞总RNA和总蛋白,采用qRT-PCR检测感染细胞中的NP mRNA表达水平,Western blot和免疫共沉淀检测HBD3和IAV HA蛋白表达水平以及HBD3和HA蛋白的相互作用。试验设未经肝素酶处理BEAS-2B细胞对照组。结果肝素酶作用48 h,其浓度在30 U/mL以下浓度时对细胞无毒性作用;HBD3干预IAV感染细胞后细胞中的NP mRNA表达水平显著降低(t=12.81、26.13、28.68,P<0.01),经肝素酶处理IAV感染的细胞其NP mRNA表达水平升高(t=-4.55,P<0.05),结果显示HBD3可抑制病毒复制,而经肝素酶处理IAV感染的细胞其病毒未减少,表明只使用肝素酶不能降低病毒感染;与未经肝素酶处理的细胞相比,经肝素酶处理的细胞中HBD3和HA蛋白表达水平降低,以及HBD3和HA蛋白的相互作用显著降低(P<0.01),表明HBD3和肝素酶共同作用可降低HA的表达来阻止IAV进入细胞。结论肝素酶和HBD3共同作用可以抑制病毒进入细胞,具有抗甲型流感病作用。