医学院校研究生分子生物学技术实验教学创新体系的构建

分子生物学技术是推动生命科学领域及其他多个相关领域学科发展的关键技术,是各个科学研究领域的必备工具。随着分子生物学的发展以及其重要性的逐渐提升,博士、硕士研究生及本科生对分子生物学技术教学的需求也日益明显且各有侧重。文章通过对研究生课程实践教学体系、教学模式、教学方法等进行教学体系构建的探索,提升实验技术课的教学效果,为培养高素质的医学院校研究生提供参考。

污水中肺炎克雷伯氏菌噬菌体的分离及其生物学特征、基因组分析

为探究噬菌体作为治疗肺炎克雷伯菌感染的新型潜在疗法的可能性,本研究采用双层平板法将医院周边污水中3株肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体进行分离纯化,透射电镜观察噬菌体形态结构,并进一步分析噬菌体裂解谱、最佳感染复数、生长曲线和酸碱耐受性等生物学特征,同时通过测序技术获得噬菌体全基因组信息并注释分析.实验结果表明,KP-ZS3为肌尾科噬菌体,KP-ZS4为短尾科噬菌体,KP-ZS6为长尾科噬菌体,且KP-ZS4的感染潜伏期稍长,KP-ZS3耐酸碱能力较强,KP-ZS6的裂解能力为3株噬菌体中最强、裂解谱较宽.3株噬菌体的外壳蛋白组分大小均在33~55 kD之间.此外全基因组分析发现KP-ZS3、KP-ZS62株噬菌体的基因组大小均在100 kb以上,噬菌体KP-ZS4的基因组相对较小(40608 bp).共线性分析显示噬菌体KP-ZS3与phiEap-3、Kp15高度相似;KP-ZS6与0507KN21、vB_EcoM_KWBSE43-6高度相似.KP-ZS4与Tyrion、TL-2011b相似度相对较低,序列一致性为76.77%、76.89%.以上结果表明,这3株噬菌体具有独特的生物学特性和基因组特征,它们在肺炎克雷伯菌感染治疗方面展现出不同的潜力和优势,特别是KP-ZS6因其裂解能力强和广泛的裂解谱,以及KPZS3因其强耐酸碱性,可能成为未来抗菌治疗的备用资源,这些发现为开发新型抗菌策略和治疗肺炎克雷伯菌感染提供了新的信息基础.

基于网络药理学的益气解毒复方对实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的免疫治疗效果及机制

目的基于网络药理学探讨益气解毒复方对实验性自身免疫性重症肌无力(MG)大鼠免疫治疗的效果及机制。方法运用中医药分子机理生物信息学分析软件(BATMAN-TCM)筛选益气解毒复方相关靶点信息,利用在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库以及Genecards数据库查询MG疾病有关靶点的信息;通过注释、可视化和综合发现数据库(DAVID)、Metascape数据库对益气解毒复方治疗MG的潜在靶点进行蛋白-蛋白互作网络(PPI)分析、基因本体(GO)功能富集及京都基因组百科全书(KEGG)相关信号通路分析;制备鼠源性乙酰胆碱受体(AChR)Rα97-116肽段抗原乳剂并皮下注射至30只无特定病原体(SPF)级雌性Lewis大鼠的尾基部、后肢垫部及背部(第1次免疫注射),分别于第30天和第45天时进行加强免疫(第2、3次免疫注射),第3次免疫注射结束后1周判断实验性自身免疫性MG(EAMG)大鼠模型是否成功,造模成功后EAMG大鼠随机均分为模型组、0.945 g/(kg·d)益气解毒复方(低剂量)组、1.890 g/(kg·d)益气解毒复方(中剂量)组、3.780 g/(kg·d)益气解毒复方(高剂量)组及5.400 mg/(kg·d)醋酸泼尼松片剂组,另取6只SPF级雌性Lewis大鼠作为正常组,各药物组大鼠分别予对应药物、正常组和模型组大鼠分别予等体积纯净水,连续灌胃干预30 d,采用电子天平和Lennon评分检测各组大鼠灌胃干预前和干预第30天时的体质量和肌力,同时采用酶联免疫吸附试剂盒检测各组大鼠血清AChR抗体(AChR-Ab)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平,采用流式细胞术方法检测各组大鼠灌胃干预第30天时外周血中白细胞分化抗原4(CD4^(+))T细胞、白细胞分化抗原8(CD8^(+))T细胞的百分比及T淋巴细胞亚群CD4^(+)/CD8^(+)比率;灌胃干预30 d后处死各组大鼠,取骨骼肌组织,采用苏木精-伊红染色(HE)评估骨骼肌组织的形态学特征。结果筛选到益气解毒复方治疗疾病相关基因168个,PPI分析预测IL-6、TNF、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、肿瘤蛋白(TP53)等可能是其治疗MG的重要靶点;GO功能富集结果表明,细胞组成(CC)、生物过程(BP)及分子功能(MF)涉及354个、4365个及61个条目,KEGG富集分析搜集到有关作用通路257条;灌胃干预第30天,与模型组相比,低、中、高益气解毒复方剂量组及醋酸泼尼松组大鼠体质量增加(P<0.01),Lennon评分降低(P<0.01),血清AChR-Ab、IL-1β、IL-6及TNF-α水平降低(P<0.05);EAMG大鼠血清中CD4^(+)T细胞分布及CD4^(+)/CD8^(+)比值减少(P<0.01),CD8^(+)T细胞分布增高(P<0.01),骨骼肌组织改善,肌纤维恢复,细胞核排列更规则,炎性细胞减少,其中益气解毒复方高剂量组效果较为明显。结论益气解毒复方可减轻EAMG大鼠炎症反应、减轻骨骼肌组织的损伤及促进免疫系统恢复,其机制与血清AChR-Ab水平降低及平衡CD4^(+)、CD8^(+)T细胞两者的比例有关。

RANK基因2个SNP位点多态性与贵州燃煤污染型地氟病患病风险的相关性

目的探讨核因子κB受体活化因子(RANK)基因rsrs1505034、rs884205单核苷酸多态性(SNP)与贵州燃煤型地氟病患病风险的关系。方法483例贵州地氟病区人群按照氟斑牙诊断标准(WS/T 208-2011)分为地氟组(283例,氟斑牙程度在极轻度及以上)和对照组(200例,氟斑牙分度正常),采用TaqMan-MGB探针法对2组人群外周血DNA样本RANK基因的rs1505034、rs884205位点进行基因分型,分析rs1505034、rs884205等位基因和基因型在两组的分布,采用SNPstats对SNP位点基因型与燃煤型地氟病发生发展的相关遗传模式进行分析,采用SHEsis对RANK基因rs1805034和rs884205位点之间进行连锁不平衡分析。结果RANK基因rs1805034位点等位基因和基因型频率在地氟组和对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);最优遗传模式分析显示,RANK基因rs1805034位点最优遗传模式为共显性,在该遗传模式下C/T基因型和T/T基因型相对于C/C基因型是燃煤型地氟病发生的保护因素(OR=0.17,95%CI为0.09~0.31;OR=0.04,95%CI为0.02~0.08);rs884205位点与燃煤型地氟病的发生无相关性(P>0.05);SHEsis分析结果显示上述2个位点之间不存在连锁不平衡(D′<0.5)。结论RANK基因rs1805034位点多态型可能与贵州燃煤型地氟病的发生相关。

贵州梭戛苗族13~17岁青少年的体型特点及发育规律

目的探讨贵州六枝梭戛乡苗族(贵州梭戛苗族)13~17岁青少年的体型特点及发育规律。方法采用分层整群抽样,选取世代居住于贵州六枝特区梭戛乡父母均为苗族或父母均为汉族、体检健康的13~17岁青少年各242、707人,将两个民族青少年分为13岁~、14岁~、15岁~、16~17岁4个年龄段,各年龄段又分男性和女性组,测量各年龄段男女性青少年身高、体质量及体质量指数(BMI)评价并比较各组青少年生长发育水平;采用Heath-Cater体型法计算内因子、中因子、外因子、Ponder指数及体型位置距离(SAD)等指标评价各组青少年的体型分类(内胚层型、中胚层型、外胚层型及中间型);根据SAD大小判断贵州梭戛苗族与其他民族青少年体型之间的差异。结果贵州梭戛苗族青少年男性身高高于女性(P<0.01)、BMI值低于女性(P<0.01),各年龄组男性内因子值小于女性(P<0.05)、外因子值大于女性(P<0.05);各年龄组男性与女性的SAD均大于1,男性体型为中间型和外胚层型,女性体型为内胚层型和中间型;贵州梭戛苗族女性身高及体质量低于汉族(P<0.01);各年龄组贵州梭戛苗族男性与贵州水族男性、广西壮族男性的SAD小于1,与湖南侗族男性、广西仫佬族男性的SAD大于1,贵州梭戛苗族女性与贵州布依族女性、贵州水族女性、广西壮族女性及西藏藏族女性的SAD小于1,与广西南宁汉族女性的SAD大于1。结论贵州梭戛苗族13~17岁青少年中,男性体型类型主要为中间型,表现为体型匀称、外形消瘦、骨骼和肌肉发育一般;女性主要体型为内胚层,体型较男性脂肪含量高,线性程度较低。梭戛苗族青少年生长发育不如当地汉族;梭戛苗族青少年体型与贵州水族、广西壮族相似。

大肠埃希菌密度感应调节子qseC基因失活突变株构建及其生物学特性

目的密度感应系统与细菌生长状态、毒力改变、生物膜形成、运动能力改变以及参与细菌和宿主的免疫反应和对药物的抗性等相关。大肠埃希菌密度调节子C(Escherichia coli quorum sensing regulator C,qseC)是其密度感应系统的受体,探究其对大肠埃希菌生理、生化特征的影响。方法使用嗜热二型内含子基因打靶系统(Thermotargetron)构建大肠埃希菌HMS174菌株qseC基因失活突变株,测定其生长速率、溶血能力、生物膜形成和运动能力等表型的变化,以及对酸碱和6种抗生素的敏感性。结果成功构建了大肠埃希菌HMS174 qseC627s位点的打靶载体,该载体基因失活效率为100%。对比大肠埃希菌HMS174与ΔqseC627s突变株的表型发现,突变株生长速率和最大生物量降低、溶血能力丧失、生物膜形成能力降低、运动能力减弱、对酸、碱的耐受能力降低。抗生素敏感性测定结果表明,ΔqseC627s对氯霉素、氨苄青霉素、四环素、阿莫西林、甲硝唑耐受性降低。结论大肠埃希菌HMS174中qseC基因缺失后,突变株表型和对抗外界压力因素发生了显著改变。

槲皮素对N2a/APP细胞的神经保护作用机制

目的探究槲皮素在稳定表达人瑞典淀粉样蛋白前体蛋白APP695的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中神经保护作用的机制。方法采用稳转APP695瑞士突变的N2a细胞(N2a/APP)为研究对象,通过CCK-8法检测槲皮素对N2a/APP细胞活力的影响;选择不同浓度槲皮素处理N2a/APP细胞,并用蛋白质印迹法(Western blot)法检测槲皮素处理后N2a/APP细胞内β-淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、25kDa突触关联蛋白(SNAP25)、突触素(Synaptophysin,SYP)和突触后致密区蛋白95(PSD95)、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(AKT)通路蛋白、胱氨酸/谷氨酸逆向转运系统的轻链亚基(xCT)蛋白及NADPH氧化酶4(NOX4)蛋白的表达水平;使用流式细胞术检测槲皮素处理后细胞活性氧自由基(ROS)和线粒体膜电位变化,免疫荧光法检测槲皮素处理后N2a/APP细胞内脂质过氧化和DNA损伤程度。结果槲皮素处理N2a/APP细胞后,APP表达显著降低,SNAP25和Synaptophysin表达明显升高,磷酸化ERK1/2水平显著降低,磷酸化AKT水平升高,NOX4表达降低,xCT表达明显升高,线粒体膜电位恢复,氧化应激、脂质过氧化和DNA氧化损伤程度降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论槲皮素对N2a/APP细胞的神经保护作用机制可能与ERK1/2和AKT通路减轻氧化应激、恢复受损突触和损伤线粒体的功能有关。

幽门螺杆菌阿莫西林稳定耐药克隆的筛选及其基因突变的检测

目的探讨阿莫西林(AMX)不稳定耐药的幽门螺杆菌(Hp)演化成AMX稳定高水平耐药的表型及其突变基因的检测。方法以冻存后的Hp菌株H390作为出发菌株,在不断增加AMX浓度的培养基上连续传代,筛选对AMX耐药的克隆,检测耐药克隆的最小抑菌浓度(MIC),置于-80℃冻存3个月后再复苏,根据冻存后MIC下降情况判断其耐药性是否稳定。对获得的AMX最高MIC值的克隆H390r和出发菌株H390进行基因组测序分析和外排泵抑制试验,检测并鉴定与H390r获得的AMX高水平耐药性相关的基因突变。结果通过AMX筛选获得4个AMX高水平耐药克隆,MIC分别为12、32、64和≥256 mg/L,经-80℃冻存后,MIC均未发生改变。相比于亲本菌株H390,AMX稳定耐药克隆H390r存在多个基因的突变,包括与AMX耐药性相关的编码RND外排系统的hefC、编码孔蛋白的hopB与hopC和编码青霉素结合蛋白的ftsI。H390r在有外排泵抑制剂存在时对AMX的MIC大幅降低。结论AMX能够在不稳定耐药的Hp中筛选出稳定耐药的克隆;H390r存在与AMX耐药相关的hefC、hopB、hopC和ftsI基因突变。这些突变可能是H390r获得AMX稳定高水平耐药的主要原因。

PIN1基因多态性与贵州地区民族间原发性高血压的研究

目的:探讨肽基脯氨酰顺反异构酶(PIN1)基因单核苷酸多态性(SNP)与贵州苗族、布依族、汉族人群原发性高血压的关联性。方法:通过病例-对照研究方法,选取贵州雷山苗族、荔波布依族及贵阳汉族的原发性高血压和健康对照人群,采用Sequenom MassARRAY基因分型技术对以上人群PIN1基因多态性位点rs2233678、rs2233679进行基因分型,分析SNP与贵州人群原发性高血压的遗传关系。结果:在贵州苗族、布依族、汉族人群中,高血压组和对照组性别和BMI间的差异均无统计学意义;高血压组的平均年龄均大于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。rs2233678、rs2233679在不同人群的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。在苗族、布依族及汉族高血压组和对照组人群中,rs2233678、rs2233679等位基因及基因型差异均无统计学意义;rs2233678和rs2233679存在强连锁不平衡,以rs2233678-rs2233679构建的单倍型GC和单倍型GT与原发性高血压不存在显著关联性;多因子降维分析显示,rs2233678、rs2233679与BMI对于贵州总人群高血压的发生具有强协同作用(χ2=9.328,P=0.002);rs2233679和BMI对于贵州苗族人群高血压的发生具有强协同作用(χ2=5.624,P=0.018);rs2233678和rs2233679对于贵州布依族人群高血压的发生具有强协同作用(χ2=5.323,P=0.021)。结论:PIN1基因rs2233678、rs2233679可能共同影响贵州人群原发性高血压的发生。

黄连素对人耐紫杉醇去势性前列腺癌细胞凋亡和IL-6/STAT3表达的影响

目的研究黄连素(BBR)对人耐紫杉醇(PTX)去势性前列腺癌细胞凋亡和白细胞介素-6(IL-6)/信号转导与转录因子3(STAT3)表达的影响。方法选取对数生长期人耐PTX前列腺癌细胞株DU145 R,用DMSO、10及20μmol/L BBR处理72 h,采用流式细胞术检测DU145 R细胞凋亡;取0、10及20μmol/L BBR处理24 h的DU145 R细胞,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)与蛋白印迹(Western blot)分别检测DU145 R细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白表达。结果与DMSO组相比,10和20μmol/L BBR组DU145 R细胞凋亡数量增加(P<0.05);与0μmol/L组比较,10和20μmol/L BBR组DU145 R细胞中IL-6与STAT3 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。结论BBR可能通过下调IL-6/STAT3表达诱导DU145 R细胞的凋亡。

黄连素对人耐紫杉醇去势性前列腺癌细胞活力、增殖及HMGB1表达的影响

目的探讨黄连素(BBR)对去势抵抗性前列腺癌(CRPC)紫杉醇(PTX)耐药细胞活力、增殖及高迁移率族蛋白1(HMGB1)表达的影响。方法取对数生长期的PTX耐药前列腺癌细胞株DU145 R,用0、5、10、20、30及50μmol/LBBR处理,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)分别于48和72 h评估6组DU145 R细胞的细胞活力;分别用二甲基亚砜(DMSO)、10及20μmol/L BBR处理对数生长期的DU145 R细胞,采用细胞克隆形成实验检测3组DU145 R细胞的克隆形成数;利用Oncomine数据库与人类蛋白质图谱数据库(HPA)分别分析HMGB1 mRNA及蛋白在前列腺癌和正常组织中的表达,利用TIMER2.0数据库分析HMGB1表达与前列腺癌患者生存的相关性;取对数生长期细胞DU145及DU145 R(分为0、10及20μmol/L BBR处理组),采用蛋白印迹法检测2组细胞中HMGB1蛋白表达。结果与0μmol/L BBR组相比,各浓度组DU145 R细胞的细胞活力降低(P<0.05);与DMSO组相比,5和10μmol/L BBR组DU145 R细胞的克隆形成数量减少(P<0.05);与正常组织相比,前列腺癌组织中HMGB1 mRNA及蛋白表达增加(P<0.001),且HMGB1高表达与前列腺癌患者不良预后相关(P=0.0193);与DU145组相比,DU145 R各组细胞HMGB1的表达明显增高(P<0.001);与0μmol/L BBR组相比,10和20μmol/L BBR组DU145 R细胞HMGB1蛋白表达下调(P<0.05)。结论BBR可抑制CRPC PTX耐药细胞增殖、细胞活力及HMGB1的表达。

蛋白激酶Cδ参与帕金森大鼠模型中6-OHDA的神经毒性作用

目的研究蛋白激酶Cδ(PKCδ)细胞核转移在帕金森大鼠模型神经元丢失中的病理作用。方法 40只雄性SD大鼠随机分为Sham组(10只)和PD组(30只),立体定位右侧纹状体注射生理盐水或6-OHDA溶液并通过阿朴吗啡(APO)诱导旋转进行模型筛选,免疫组化检测黑质致密部(SNpc)酪氨酸羟化酶(TH)表达情况。采用Western blotting检测PKCδ蛋白表达并通过共聚焦观察PKCδ在细胞核的表达。结果 PD组SNpc部位TH阳性神经元形态发生了病理改变且密度显著下降(P<0.05);Western blotting显示PD组SNpc组织中PKCδ及Cleaved PKCδ的表达较Sham组显著上调(P<0.05);共聚焦显微镜提示PD组SNpc部位PKCδ与细胞核有共定位。结论 PKCδ的酶解激活及细胞核转位可能参与了PD的神经病理发生。

PEG介导黄曲霉菌的遗传转化体系

目的:以吡啶硫胺抗性基因(ptrA)为筛选标记基因,建立黄曲菌遗传转化体系。方法:通过黄曲霉菌对潮霉素B(Hyg)、新霉素(G418)和嘧啶磺胺素(PT)的敏感性实验获得适合黄曲霉菌遗传转化筛选抗生素,用酶解的方法获得黄曲霉菌的原生质体;采用聚乙二醇(PEG)介导黄曲霉菌原生质体转化法,将携带ptrA的质粒pPTRI整合到黄曲菌株LD-F基因组DNA中,随机挑选7个转化子,通过聚合酶链反应(PCR)方法进行检测,验证ptrA是否整合到黄曲菌基因组DNA中。结果:0.2 mg/L PT可以完全抑制黄曲霉菌的菌丝生长,1%溶壁酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶处理黄曲霉菌丝2 h可得到大量的原生质体;PCR检测结果显示,质粒pPTRI能够成功整合到黄曲菌基因组。结论:以PT为抗性筛选,建立PEG介导黄曲霉菌的遗传转化体系。

人耐紫杉醇去势性前列腺癌细胞系的构建

目的构建人耐紫杉醇(PTX)去势性前列腺癌细胞模型。方法培养人细胞株DU145细胞,逐渐增加PTX的浓度(1、4、6、8、10及12 nmol/L)处理细胞;以12 nmol/L浓度处理后存活的DU145细胞作为PTX耐药细胞株(命名为DU145 R)、DU145细胞作为对照,采用细胞增殖检测(CCK8)法检测DU145和DU145 R细胞的细胞活力、光学显微镜下观察细胞核形态、实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞多药耐药基因1(MDR 1)和c-Myc mRNA表达水平、Western blot法检测细胞MDR1和c-Myc蛋白表达水平。结果与DU145细胞比较,显微镜下观察发现DU145 R细胞核里有多核化现象,DU145 R细胞活力明显高于DU145细胞(P<0.01),MDR1及c-Myc mRNA和蛋白表达水平明显高于DU145细胞(P<0.01)。结论成功构建DU145 R细胞,该细胞MDR 1及c-Myc表达水平上调,对PTX耐药。

真菌病毒AfPV1对寄主黄曲霉抗压力耐受的影响

目的探讨真菌病毒Af PV1感染后对寄主黄曲霉抗渗透压、氧化、细胞壁压力、紫外照射、巨噬细胞杀灭以及对细胞黏附的影响。方法将脱病毒菌株(LD-F1)及Af PV1感染菌株(LD-F1-b)黄曲霉孢子接种到含有细胞壁胁迫应激试剂、渗透压胁迫试剂和氧化试剂的YGM培养基、30℃黑暗培养5 d、检测病毒Af PV1对黄曲霉抗压力的影响;通过紫外线照射SDA培养基上的黄曲霉孢子,30℃黑暗培养48 h检测病毒Af PV1对黄曲霉抗紫外照射的影响;黄曲霉孢子与巨噬细胞(RAW264.7)和人肺上皮细胞(A549)共培养,比较黄曲霉孢子死亡率和黏附水平;通过黄曲霉孢子与巨噬细胞(RAW264.7)共培养后收集上清液检测白介素-10(IL-10)、IL-6、IL-1β、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)水平。结果真菌病毒Af PV1减弱了黄曲霉对渗透、氧化和紫外线的抵抗压力,但对细胞壁抗压能力无影响;真菌病毒Af PV1的感染能够降低黄曲霉对人肺上皮细胞A549的黏附能力,同时降低黄曲霉抵抗巨噬细胞杀灭能力;黄曲霉感染后,巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α,真菌病毒Af PV1感染黄曲霉会导致巨噬细胞有增加肿瘤坏死因子-α的产生趋势,但结果不显著。结论真菌病毒Af PV1感染能够降低寄主黄曲霉抗压能力。

基于RNA-Seq技术的真菌病毒AfPV1感染对寄主黄曲霉基因表达的影响

目的基于转录组测序(RNA-Seq)技术探讨真菌病毒黄曲霉(A.flavus)partitivirus 1(AfPV1)感染对寄主A.flavus基因表达的影响。方法分别提取无病毒感染的A.flavus菌株LD-F1和真菌病毒AfPV1感染的A.flavus菌株LD-F1-b的RNA进行文库构建和RNA-Seq;以A.flavus菌株NRRL 3357(GCA_009017415.1)的基因组为参考,分析RNA-Seq测序结果中有差异表达的基因(DEGs),并对DEGs进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析;随机选取12个DEGs,使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对转录组进行验证。结果样品RNA完整无污染,测序结果可靠,错误率0.02%,测序的结果能够成功比对到A.flavus的基因组序列(>56%);获得真菌病毒AfPV1感染的A.flavus的DEGs有4127个;GO富集分析显示,DEGs涉及A.flavus的氧化还原过程、单生物过程、单生物代谢过程、跨膜转运、谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程、谷氨酰胺家族氨基酸生物合成过程、二羟酸代谢过程及血红素结合等;KEGG富集分析显示,DEGs参与A.flavus代谢通路中的戊糖与葡萄糖醛酸互相转换、非同源重组末端连接、氮代谢、错配修复、同源重组、DNA复制、次级代谢产物的生物合成及碱基切除修复等;qRT-PCR的结果与转录组测序结果趋势一致。结论真菌病毒AfPV1感染A.flavus能够引起基因表达差异,DEGs涉及A.flavus生命过程中多个基因和多个信号通路。

贵州汉族、苗族和布依族原发性高血压与载脂蛋白E基因单核苷酸多态性的关系

目的 探讨载脂蛋白E(ApoE)基因单核苷酸多态性(SNP)与贵州汉族、苗族、布依族人群原发性高血压(EH)的关联性。方法 通过病例-对照研究方法,选取贵州雷山苗族、荔波布依族及贵阳汉族原发性高血压患者343例(苗族110例,布依族119例,汉族114例)和健康对照335例(苗族111例,布依族117例,汉族107例),并收集年龄、性别、身高、体质量、空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油等临床资料和生化指标,采用t检验或χ^(2)检验比较两组临床资料与生化指标的差异。分别采用Sequenom MassARRAY和竞争性等位基因特异性PCR(KASP)基因分型技术对以上人群ApoE基因5个SNP位点(rs7259620、rs440446、rs769449、rs1065853、rs439401)和2个SNP位点(rs429358、rs7412)进行基因分型,采用logistic回归分析ApoE基因多态性与贵州人群EH的遗传关系。结果 在贵州苗族和布依族人群中,没有发现与EH关联的SNP位点。汉族人群rs439401等位基因及基因型在EH组和对照组的分布差异具有统计学意义(χ^(2)=6.438,P=0.011和χ^(2)=6.389,P=0.041)。与TT或TC基因型相比,CC基因型增加EH的患病风险(OR=2.164,95%CI 1.035~4.526,P=0.040)。与单倍型G-G-T(rs7259620-rs1065853-rs439401)相比,单倍型G-G-C降低汉族人群原发性高血压的患病风险(OR=0.465,95%CI 0.263~0.824,P=0.008)。多因子降维分析结果显示,rs440446,rs429358,rs7412对于苗族EH的发生具有交互作用(χ^(2)=10.012,P=0.002);rs7259620,rs1065853,rs439401对于布依族EH的发生具有交互作用(χ^(2)=3.972,P=0.046);rs7259620,rs440446,rs439401对于汉族EH的发生具有交互作用(χ^(2)=10.155,P=0.001)。结论 ApoE基因rs439401位点及单倍型G-G-C(rs7259620-rs1065853-rs439401)可能与贵州汉族EH的发生有关联。

阿糖胞苷对人急性髓系白血病细胞活力、凋亡的作用及机制

目的探讨阿糖胞苷(Ara-C)对人急性髓系白血病(AML)细胞活力、凋亡的作用及机制。方法选取对数生长期人AML细胞株MV4-11,分别用二甲基亚砜(DMSO)及0.5、1.0、1.5μmol/L Ara-C作用24、48和72 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)和流式细胞仪检测各组细胞不同时间的光密度(OD)值和细胞凋亡情况;取对数生长期MV4-11细胞分为空白组和1.0μmol/L Ara-C组,1.0μmol/L Ara-C组细胞分别处理3、6、12、24及48 h,采用蛋白印迹法检测各组MV4-11细胞中Caspase 3、c-Myc及高迁移率族蛋白1(HMGB1)的蛋白表达;利用cBioportal在线分析工具和R包(survminer)分析c-Myc表达水平与AML患者生存期的相关性。结果与DMSO组相比,0.5、1.0及1.5μmol/L Ara-C组MV4-11细胞不同时间的细胞活力均降低、凋亡细胞比例升高,且对Ara-C均有浓度依赖性(P<0.0001或P<0.01);与DMSO组相比,1.0μmol/L Ara-C组MV4-11细胞经不同时间处理后Caspase 3表达水平均降低,且有时间依赖(P<0.05);与DMSO组相比,1.0μmol/L Ara-C组MV4-11细胞经不同时间后,细胞的HMGB1和c-Myc蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);c-Myc高表达与AML患者较差生存期呈正相关((P<0.05)。结论Ara-C可抑制人AML细胞活力和诱导细胞凋亡,其机制可能与HMGB1/c-Myc的下调有关。

抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对冈田酸诱导原代星形胶质细胞衰老情况的影响

目的研究冈田酸(OA)诱导的原代星形胶质细胞中通过抑制磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/糖原合成激酶(GSK)-3β信号通路对p21、p53衰老蛋白表达水平和衰老阳性细胞表达的影响,探讨OA诱导星形胶质细胞衰老情况及相关机制。方法免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞,CCK8法筛选OA药物浓度,然后用LY294002、OA分别处理或联合处理细胞,Western印迹测定细胞中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平的变化及β-半乳糖苷酶染色检测衰老阳性细胞。结果免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞结果显示其纯度达到95%以上,CCK8法筛选出OA药物处理浓度为30 nmol/L,OA组中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达较正常对照组显著升高(P<0.05),衰老阳性细胞数明显增加,但LY294002+OA组p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平较OA组明显降低,并且衰老阳性细胞数也明显减少(P<0.05)。结论通过OA处理能使星形胶质细胞发生衰老,LY294002处理能通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路缓解细胞的衰老情况,提示高磷酸化Tau诱导星形胶质细胞衰老可能与PI3K/AKT/G3K-3β信号通路密切相关。

二十二碳六烯酸对甲基苯丙胺诱导的人神经母细胞瘤细胞神经毒性的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)对甲基苯丙胺(METH)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞神经毒性的作用及其作用机制。方法体外培养SH-SY5Y细胞,分为Control组、METH组以及METH+DHA组。显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态,测量并计算细胞长轴和短轴的比值,通过流式细胞术检测各组SH-SY5Y细胞凋亡水平。采用蛋白质组学分析METH引起的SH-SY5Y蛋白组改变,并筛选加入DHA后表达回调的蛋白。结果与Control组比较,METH组SH-SY5Y细胞神经突明显短缩,长轴与短轴比值减小(均P<0.05);与METH组比较,METH+DHA组神经突伸长,细胞长轴与短轴比值增大(均P<0.05)。与Control组比较,METH组早期细胞凋亡和晚期细胞凋亡比例升高,且总凋亡细胞比例也明显升高(均P<0.05);与METH组比较,METH+DHA组晚期细胞凋亡和总凋亡细胞比例降低(均P<0.05)。蛋白组学分析显示,加入DHA可以将22个METH诱导下表达变化的蛋白反向调节,涉及了核糖体、细胞骨架和谷胱甘肽代谢等生物学功能。结论DHA可减弱METH诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性,其机制可能与DHA调控角蛋白表达,改善谷胱甘肽代谢等信号通路有关。