“缺陷性实验”在医学生物化学实验教学中的应用

医学生物化学实验课程教学是其理论课程教学的重要补充。传统实验教案设计合理、条件优化,学生难以建立整体实验设计的思维模式。“缺陷性实验”在原实验案例基础上,通过针对性破坏实验中重要环节的完整性和严谨性,主动形成“缺陷”,为培养学生科学的实验思维,强化其发现问题、解决问题的能力,提供了新的教学模板。文章围绕“缺陷性实验”案例的创建,设计思路,实施及应用意义等进行探讨,以期为新时代教育背景下,医学生物化学实验课程的教学实践提供新的线索和思路。

设计性实验在“生物化学实验”教学中的探索与实践

目的:探讨设计性实验在生物化学实验教学中的效果。方法:选取100名2年级临床医学专业本科学生为研究对象,在掌握了基本的实验技术基础上,教师规定以"某种蛋白质或酶的分离、纯化及鉴定"为设计性实验的内容,学生首先分组,查阅文献,撰写实验方案;然后进行PPT汇报,师生交流,确定可行的设计方案;最后完成实验,并对实验结果和教学效果进行评价。结果:发放问卷调查表100份,收回99份,问卷回收率为99%。100%的学生认为设计性实验能提高学习积极性和学习兴趣,培养自学及独立思考能力,98%的学生认为可继续在生物化学实验教学中开展设计性实验教学。结论:在生物化学实验教学中开展设计性实验可取得良好的教学效果。

贵阳市大学生结核病防治知信行调查分析

目的:了解贵阳市在校大学生结核病防治知识、态度行为及影响因素,为高校创新方式开展及时有效的结核病健康宣教提供参考。方法:于2022年3月7日至4月7日,采用多阶段分层整群抽样的方法,抽取贵州医科大学、贵州理工学院和贵阳学院在校大学生2894名开展结核病防治相关问卷调查,实际调查2801名,获得有效问卷共2608份。调查问卷为自行设计的电子问卷,运用χ^(2)检验及多因素logistic回归模型分析知识知晓率的影响因素。结果:贵阳市在校大学生总知晓率为69.14%(27048/39120),核心知识知晓率为79.00%(10301/13040),延伸知识知晓率为64.21%(16747/26080)。单因素与多因素分析表明,性别、年级和专业是结核病防治核心知识(χ^(2)分别为12.376、77.729、38.480,P值均<0.001)及延伸知识(χ^(2)值分别为27.993、21.616、40.999,P值均<0.001)知晓率的影响因素,其中女性(OR=1.462,95%CI:1.242~1.721)、大学三年级(OR=1.291,95%CI:1.039~1.604)、毕业班(OR=2.697,95%CI:2.118~3.435)和医学专业(OR=1.880,95%CI:1.594~2.216)学生的知识总知晓率分别高于男性、大学一年级和非医学专业学生。在对待结核病态度和行为上,96.13%(2507/2608)的学生愿意参与结核病防治知识宣传,积极性高。结论:贵阳市高校学生具备一定的结核病防治知识,和较为积极的防治态度与行为,但仍存在不足,应针对男性、低年级、非医学专业的学生开展更精准的健康教育。

P3肽抑制RAW264.7巨噬细胞泡沫化的分子机制

目的观察P3肽对RAW264.7巨噬细胞脂质沉积的影响,并探讨其作用机制。方法采用MTT法筛选P3肽及氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)的作用浓度,并用80 mg·L^(-1)的ox-LDL诱导RAW264.7细胞形成泡沫细胞;分别采用油红O染色和总胆固醇含量测定试剂盒,检测细胞内脂质沉积及总胆固醇含量;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及Western blot检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)的mRNA和蛋白表达变化;分别应用肝X受体(liver X receptor,LXR)的激动剂T0901317、GW3965,以及LXR抑制剂GSK2033进一步验证P3肽调控ABCA1、ABCG1表达的作用机制。结果P3肽明显减少RAW264.7细胞内脂质沉积,降低细胞内总胆固醇含量,上调ABCA1、ABCG1mRNA和蛋白表达;P3肽上调ABCA1、ABCG1的作用与LXR激动剂T0901317、GW3965相似;加入抑制LXR基因转录的抑制剂GSK2033后,P3肽对ABCA1、ABCG1的基因表达无上调作用。结论P3肽可减少RAW264.7巨噬细胞内脂质积聚,抑制泡沫细胞的形成,其作用机制可能与激活LXR-ABCA1/ABCG1通路有关。

贵州关岭余甘子内生真菌多样性及其抗菌抗氧化活性

目的:了解贵州关岭余甘子内生真菌的多样性,探究余甘子果汁抗氧化及抑菌功能的相关性。方法:取贵州省关岭县10月份野生健康成熟新鲜的余甘子果实,采用研磨法获得余甘子果汁;采用组织分离法对果实进行内生真菌分离,按照菌丝尖端切割法接种至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基纯化3次并保存;取本校真菌室提供的标准菌株,采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离获得的真菌菌株DNA、并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其内转录间隔区(ITS)基因序列后测序,采用分子系统学方法对分离获得的真菌菌株进行鉴定、归类及多样性评估,采用邻接法(N-J)基于ITS序列构建系统发育树;摇床培养提取内生菌发酵液,采用纸片扩散法对发酵液和余甘子果汁进行抑菌活性测试,并绘制维生素C(Vc)标准曲线测定菌株的总抗氧化能力。结果:余甘子果实中分离出内生真菌43株,其中青霉属19株、横梗霉属9株、间座壳属11株、叶点霉属1株、葡萄座腔菌属3株,青霉属为优势属,其中Penicillium chrysogenum分离出15株,数量最多,为优势菌种;ITS序列比对结果显示,分离株43株、标准株5株,构建N-J系统发育树;43株内生真菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白念珠菌均无抑制效果,余甘子果汁对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较明显效果,但对白念珠菌无抑制效果;Vc标准曲线回归方程为y^=0.8095 x-0.0828,R^2=0.9937,经样品测试,43株菌的发酵液总抗氧化能力明显高于空白培养基,相对于Vc的抗氧化能力范围104.76~156.64 mg/L。结论:分离出的余甘子内生真菌中,青霉属为优势菌属,P.chrysogenum为优势菌种;2株内生真菌具有较强的抗氧化作用,分离出的43株内生真菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及白色念珠菌均无明显抑制效果。

人Shisa样蛋白1(SHISAL1)抗原表位区预测及其小鼠多克隆抗体的制备

目的优化人Shisa样蛋白1(SHISAL1)抗原后制备小鼠抗多克隆抗体,并鉴定抗体特异性.方法利用生物信息学方法预测SHISAL1蛋白的抗原表位区,选取SHISAL1蛋白第28~97位氨基酸残基组成的多肽作为抗原,并命名为(SHISAL1-N);利用分子克隆技术,将其编码序列克隆后插入pET-28a载体中构建重组质粒pET28a-SHISAL1-N.然后将pET28a-SHISAL1-N和已构建的pET28a-SHISAL1全长重组质粒转化BL21(DE3),用异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.两种蛋白纯化后分别免疫雌性昆明小鼠,Western blot法、免疫沉淀及免疫荧光细胞化学染色法观察两种抗体的特异性与灵敏性.结果成功构建pET28a-SHISAL1-N重组质粒,诱导两种融合蛋白表达,获得两种类型的SHISAL1小鼠多克隆抗体.Western blot结果表明以SHISAL1为免疫原所制备的抗体特异性和灵敏性较差,而以SHISAL1-N免疫原所制备的抗体能特异性识别不同的细胞内源性的SHISAL1蛋白;免疫沉淀结果表明SHISAL1-N抗体可以结合肝癌细胞中的SHIISAL1蛋白;免疫荧光细胞化学染色结果证明SHISAL1-N抗体与细胞质中的SHISAL1蛋白特异性结合.结论成功优化SHISAL1抗原并制备了小鼠抗人SHISAL1多克隆抗体,可应用于Western blot实验、免疫沉淀和免疫荧光细胞化学染色.

苦荞蛋白源肽AFYRW对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的影响

目的:探讨苦荞蛋白源肽AFYRW在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的血管内皮细胞损伤中的作用。方法:采用LPS诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)建立血管内皮细胞炎症损伤模型;采用CCK8试剂盒检测AFYRW对细胞增殖活力的影响;Western blot检测血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhension molecule-1,VCAM-1)、细胞内黏附分子-1(intercellular adhension molecule-1,ICAM-1)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)水平及核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)p65的磷酸化水平;酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)的含量变化;单核细胞黏附实验检测HUVECs的黏附性。结果:AFYRW明显提高了细胞的生存活力,降低VCAM-1、ICAM-1、IL-6、TNF-α、iNOS蛋白的相对表达量,减少了NO含量和单核细胞对内皮细胞的黏附,抑制NF-κB的活性。结论:AFYRW对LPS诱导的HUVECs炎症具有改善作用,其机制可能与抑制NF-κB的活性有关。

登革病毒-2感染人脐静脉内皮细胞的磷酸化蛋白质组学分析

目的对登革病毒-2(DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的差异磷酸化蛋白质进行分析以及初步探究DENV-2感染的可能致病机制。方法实验设置DENV-2感染HUVEC组和HUVEC空白对照组,每组3个重复。收集细胞沉淀后,利用SDT裂解法获取蛋白质,通过串联质谱标签(TMT)法对磷酸化蛋白质进行定性与定量分析,对鉴定到的差异磷酸化蛋白质进行氨基酸保守基序分析、亚细胞定位分析、蛋白质结构域分析、GO富集分析、KEGG通路分析和蛋白质互作(PPI)等生物信息学分析。利用Western blot检测JUN、MAP2K2和AKT1磷酸化蛋白的表达。结果共检测到1385个差异蛋白质上的2918个修饰肽段,其中有1346个修饰肽段显著上调(FC>1.2,P<0.05),1572个修饰肽段显著下调(FC<0.83,P<0.05)。氨基酸保守基序分析共获得49个磷酸化保守基序。蛋白质结构域分析中富集到的差异磷酸化肽段最多是RNA识别基序、蛋白激酶结构域和PH结构域。通过亚细胞定位分析发现差异的修饰肽段主要定位在细胞核和细胞质中。GO富集和KEGG通路分析结果显示差异肽段主要在刺激反应的调节、含核碱基的小分子生物合成过程、吞噬体和白细胞跨内皮迁移处富集。对上调和下调的差异磷酸化蛋白分别进行蛋白质互作—KEGG联合分析,结果发现上调和下调的差异磷酸化蛋白质共富集到15条通路,且通过Western Blot检测与自噬途径相关的3个差异磷酸化蛋白质即JUN、MAP2K2和AKT1的表达,结果显示DENV-2组与空白组相比,p-JUN表达显著下调(1.48±0.01 vs 1.23±0.01,P<0.0001);p-AKT1表达显著上调(0.87±0.02 vs 1.01±0.01,P<0.001);p-MAP2K2表达显著上调(1.10±0.02 vs 1.29±0.05,P<0.01)。结论DENV-2感染HUVEC存在较多差异表达蛋白,p-JUN的下调、p-MAP2K2和pAKT1的上调提示3个能够调节自噬的磷酸化蛋白可能与DENV-2感染机制有关。

瘤果黑种草子对小鼠急性酒精性肝损伤的影响

目的:探讨瘤果黑种草子对小鼠急性酒精性肝损伤的影响。方法:50只昆明小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组及瘤果黑种草子高、低剂量组,除正常对照组外,其余各组给予56度白酒(10 m L/kg)灌胃建立急性酒精性肝损伤模型,正常对照组给予等量生理盐水;灌胃同时,阳性对照组灌胃葵花护肝宁,瘤果黑种草子高、低剂量组分别灌胃黑种草子水提液6 g/kg或2 g/kg进行灌胃,连续10 d,灌胃期间观察小鼠的体重、精神、活动及毛色等情况;最后一次灌胃后10 h时取血检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平,同时称取小鼠体质量和肝脏质量,计算肝指数,观察小鼠肝组织外观及肝组织病理学改变。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠体重减轻,嗜睡,毛发光泽度下降;瘤果黑种草子组小鼠情况明显改善,小鼠毛发光滑整齐,体质量增长恢复正常,高剂量组最为明显;小鼠体质量和肝指数比较,模型组低于正常对照组,瘤果黑种草子组高于模型组(P<0.05);血清ALT及AST活性比较,模型组高于正常对照组,瘤果黑种草子组低于模型组(P<0.05);模型组小鼠肝组织外观呈黄褐色、正常对照组呈红褐色,瘤果黑种草子组介于两组之间,高剂量组更接近正常对照组;HE染色结果显示,模型组小鼠肝细胞明显气球样变性、坏死,并伴有少量炎症细胞浸润;与模型组比较,高剂量瘤果黑种草子组小鼠肝细胞的病理学改变减轻。结论:高剂量瘤果黑种草子水提液对小鼠急性酒精性肝损伤有保护作用。

不同品系小鼠侵袭性真菌感染动物模型的构建

目的探讨不同品系小鼠侵袭性真菌感染动物模型的构建方法。方法取白念珠菌ATCC10231 T菌株(标准菌株)、GYWu27菌株[临床艾滋病(AIDS)病人来源]、GYF76菌株[临床外阴阴道念珠菌病(VVC)病人来源]、N110菌株(健康人来源)及新生隐球菌H99^(T)菌株(标准菌株)培养至对数生长期,离心重悬于无菌盐水中,采用分光光度法及细胞计数板调整菌液浓度至所需浓度;4~6周龄SPF级KM小鼠和Balb/c小鼠各30只,随机均分为5组,分别注射浓度1×10^(6)、1×10^(7)、1×10^(8)、1×10^(9)及1×10^(10) CFU/L白念珠菌ATCC10231 T菌株,观察14 d内小鼠的死亡速率筛选侵袭性真菌感染的最适浓度;取4~6周龄SPF级KM小鼠和Balb/c小鼠各50只,随机均分为GYWu27组、GYF76组、N110组、H99^(T)组及生理盐水(Saline)组,各菌株感染组小鼠经侧尾静脉注射最适浓度菌液感染、Saline组小鼠注射Saline,记录各组小鼠30 d内的一般状态、体质量及90 d内的生存情况;取GYWu27组、GYF76组及N110组死亡小鼠的肾脏、H99^(T)组小鼠脑组织及定期分批处死的Saline组小鼠肾脏和脑组织分别制作组织匀浆、稀释后接种于含0.05%氯霉素葡萄糖琼脂培养基(SDA)、检测肾脏和脑组织的真菌负荷量,接种于SDA、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)鉴定分离后菌株;取GYWu27组、GYF76组、N110组两种系小鼠肾脏、肝脏及H99^(T)组两种系小鼠的肾脏、肝脏及脑组织,制作组织切片,观察组织学特征。结果侵袭性真菌感染动物模型Balb/c小鼠和KM小鼠的最适感染浓度分别为1×10^(8) CFU/L和1×10^(9) CFU/L;相同实验条件下,感染后KM小鼠一般状态较Balb/c小鼠好,白念珠菌及新生隐球菌感染的KM小鼠30 d内的体质量变化明显;白念珠菌和新生隐球菌体外培养菌株及感染小鼠体内分离菌株的培养特性无差异;白念珠菌感染的Balb/c小鼠靶器官真菌负荷量明显高于KM小鼠;新生隐球菌感染小鼠病变集中于脑组织,白念珠菌感染小鼠病变集中在肾脏。结论采用静脉感染方式、以1×10^(8) CFU/L白念珠菌和1×10^(9) CFU/L新生隐球菌分别感染Balb/c小鼠和KM小鼠,可构建稳定的侵袭性真菌感染动物研究模型。

维药黑种草子对急性乙醇性肝损伤小鼠保护作用及抑制NF-κB炎性反应信号通路的研究

目的:观察维药黑种草子对急性乙醇性肝损伤小鼠保护作用及对NF-κB炎性反应信号通路的抑制作用。方法:50只昆明小鼠随机分为模型组、空白组、阳性对照组、黑种草子水提液高剂量组(6 g/kg)、黑种草子水提液低剂量组(2 g/kg)。除空白组外,其余各组每日均灌胃给予56度白酒10 m L/kg,连续灌胃15 d。禁食不禁水10 h后,观察小鼠一般状态,检测体质量,肝重,肝指数,肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),肝组织核因子κB(NF-κB)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,并进行肝组织病理学检查。结果:与空白组相比,模型组小鼠体质量和肝指数均降低,血清ALT及AST活性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,黑种草子水提液各组小鼠肝体质量和肝指数有所升高,血清ALT及AST活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组小鼠肝细胞明显气球样变性、坏死和并伴有少量炎细胞浸润,黑种草子水提液组较肝损伤模型组病变情况显著减轻。模型组NF-κB及TNF-α表达强度均高于空白组,黑种草子各给药组较模型组NF-κB及TNF-α表达强度均下降。结论:黑种草子水提液对急性乙醇性肝损伤小鼠具有一定保护作用,并且能明显抑制小鼠肝细胞NF-κB及TNF-α的表达。

shRNA沉默HuR抑制肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移及侵袭能力

人抗原R (human antigen R,HuR)基因在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达。推测HuR基因也参与肝癌的发展过程。为探索HuR对肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭的作用,本研究通过蛋白质印迹实验,检测HuR在肝细胞癌细胞系和正常肝细胞中蛋白质的表达水平。结果显示,肝细胞癌细胞系SMMC-7721 HuR的表达量显著高于正常肝细胞HL-7702。合成特异性靶向HuR基因的shRNA,转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721,检测结果发现,HuR基因表达量下调90%。沉默HuR,实时细胞分析技术(real time cell analysis,RTCA)结果显示,细胞增殖能力降低55%,侵袭能力下降75%;细胞划痕实验结果显示,迁移能力下降80%;克隆形成实验中细胞克隆数减少85%;此外,在HuR敲低稳转肝细胞癌细胞系SMMC-7721细胞中过表达Bcl-2,其细胞学现象部分获得逆转。激光共聚焦扫描系统检测结果显示,Bcl-2主要定位于肝细胞癌细胞系SMMC-7721的核膜及胞质。蛋白质印迹法检测结果显示,沉默HuR,Bcl-2下调92%,Survivin下调55%,Twinst1下调69%,N-钙黏着蛋白(N-cadherin)下调48%,E-钙黏着蛋白(E-cadherin)上调1.5倍。以上结果表明,HuR可能通过调控定位于核膜及胞质上的Bcl-2来参与肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移、侵袭及克隆形成过程,HuR基因有望成为临床上治疗肝癌的一个新的潜在靶点。

菌丝特异性基因和Candidalysin对白念珠菌培养特性及致病性的影响

目的探讨菌丝特异性基因(ECE 1)和Candidalysin对白念珠菌培养特性及致病性的影响。方法选取ece 1Δ/Δ菌株(ECE 1基因敲除菌株)、ece 1Δ/Δ+ECE 1菌株(ECE 1基因敲除回补菌株)、BWP17菌株(CiP30质粒转化的亲本菌株)及M2174菌株(Candidalysin毒素敲除菌株),采用沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)37℃培养48 h并观察其培养特征,使用牛血清白蛋白培养基、卵黄培养基及三丁酸甘油酯培养基检测4种菌株的胞外水解酶活力,采用菌丝诱导实验观察4种菌株的菌丝形成能力;取4~6周龄Balb/c雌性小鼠70只,均分为BWP17组、ece 1Δ/Δ组及ece 1Δ/Δ+ECE 1组、M2174组及生理盐水(Saline,阴性对照)组,各组小鼠分别侧尾静脉注射2×10^(8) CFU/L上述4种菌液及等量Saline,观察各组小鼠注射后30 d内的体质量变化和90 d内的死亡情况,同时取各组死亡小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏制作切片、采用苏木精-伊红染色(HE)后观察各组组织的病理学特征。结果白念珠菌的菌落特征均表现为菌落较大、光滑湿润、呈奶油状圆形分布,在CHROMagar Candida培养基上的菌落颜色显示为浅绿色到深绿色;胞外水解酶检测结果显示ece 1Δ/Δ+ECE 1组、BWP17组及ece 1Δ/Δ组的蛋白酶(SAP)及磷脂酶(PL)活力强,脂肪酶(Lip)活力阴性,但M2174组只有磷脂酶活力高表达;白念珠菌ece 1Δ/Δ+ECE 1菌株的菌丝形成能力最强,ece 1Δ/Δ菌株菌丝形成能力最弱;感染白念珠菌后小鼠第28天时死亡率为21.43%~57.14%,第90天时死亡率为78.57%~100.00%;各感染组死亡小鼠肾脏的病理学改变情况最为明显,心、肝、脾及肺等病变较轻,以慢性炎症为主。结论ECE 1基因的表达增强了白念珠菌胞外水解酶的活力及其菌丝形成能力,ECE 1基因编码的Candidalysin对感染小鼠发挥了重要的毒力作用。

小鼠抗人Shisa样蛋白1(SSL1)多克隆抗体的制备和应用

目的制备抗Shisa样蛋白l(SSLl)的多克隆抗体,并探讨其在SMMC-7721肝癌细胞中的定位。方法通过反转录PCR从HepG2肝癌细胞中克隆人SSL1基因,将其插入到pET-28a中构建pET28a-SSLl原核表达载体,导入大肠杆菌BU1(DE3)中,用异丙基-B-D-硫代半乳毗喃糖昔(IPTG)诱导融合蛋白大量表达,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白;然后,利用纯化的蛋白免疫雌性昆明小白鼠,Western blot法鉴定抗体特异性,免疫荧光细胞化学染色法观察SSL1在SMMC-7721亚细胞中的表达,并用高尔基体荧光探针Golgi-Tracker Red对高尔基复合体进行标记以明确SSL1在SMMC-7721亚细胞中的定位。结果成功扩增SSL1基因,构建重组原核表达质粒pET28a-SSLl,经诱导获得较高纯度的SSL1蛋白,制备了抗SSL1多克隆抗体。免疫荧光染色结果显示,SSL1主要在SMMC-7721细胞的细胞质中表达,Golgi-Tracker Red标记结果表明,SSL1主要定位于SMMC-7721细胞的高尔基体上。结论成功制备了有较高特异性的小鼠抗SSL1多克隆抗体,并确定SSL1定位于SMMC-7721细胞的高尔基体。

苦荞清蛋白酶解物对高糖诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的保护作用

目的:建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,观察苦荞清蛋白酶解物(tartary buckwheat albumin hydrolysate,TBAH)对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响。方法:采用碱性蛋白酶水解苦荞清蛋白制备TBAH,超滤法截留分子质量小于3 kDa的TBAH;利用高糖高胰岛素诱导HepG2细胞36 h建立胰岛素抵抗模型,以2.5、5、10μg/mL的TBAH培养细胞24 h。观察TBAH对HepG2细胞葡萄糖代谢的影响;检测细胞氧化损伤指标(一氧化氮(nitric oxide,NO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和活性氧(reactive oxygen species,ROS))水平;Western blot检测胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路中相关蛋白表达情况。结果:与IR模型组相比,TBAH组葡萄糖消耗量显著增多(P<0.05),且呈剂量依赖性,同时MDA、NO和ROS水平显著降低(P<0.01,P<0.05),SOD活力显著升高(P<0.05),LDH活力显著下降(P<0.05);p-IRS-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),磷酸化Akt、PI3K、葡萄糖转运蛋白4表达水平极显著上升(P<0.01)。结论:TBAH通过抑制氧化应激改善胰岛素抵抗。

柚皮素促进Nrf2/Ⅱ相解毒酶活性并降低血管炎症反应

目的柚皮素对核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)/Ⅱ相解毒酶活性的作用及其对血管炎症反应影响的研究。方法Western blot、免疫荧光、逆转录-qPCR检测蛋白的表达。Ⅱ相酶活性检测通过相关试剂盒进行。利用免疫共沉淀技术分析Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap-1)的相互作用。结果柚皮素促进RAW264.7细胞中Nrf2与Keap-1的解离和核内的聚集,并提高Ⅱ相解毒酶的表达,包括NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO-1)、谷胱苷肽S-转移酶(GST)和谷胺酸半胱氨酸连接酶(GCL)。同时,柚皮素抑制细胞炎症因子的产生;而Nrf2抑制剂ML385使NQO-1、GST和GCL表达降低、炎症因子的含量提高。另外,检测还发现柚皮素同样通过Nrf2的作用,提高动脉粥样硬化模型小鼠肝脏NQO-1、GST和GCL的表达以及酶的活性,降低主动脉血管的炎症反应。结论柚皮素激活Nrf2,促进相关的Ⅱ相解毒酶活性,从而抑制血管炎症。

苦荞抗氧化肽AFYRW稳定性研究

为研究苦荞抗氧化肽AFYRW在生产加工、胃肠消化中的稳定性以及细胞毒性,以羟自由基(·OH)清除率和DPPH自由基清除率作为评价指标,研究pH值、温度、反复冻融、金属离子以及胃肠消化对苦荞抗氧化肽AFYRW体外抗氧化活性的影响,以红细胞溶血率评价细胞毒性。结果表明:高温、反复冻融、Na+、Mg^(2+)对抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性无显著影响;Ca^(2+)会降低抗氧化肽AFYRW的DPPH自由基清除率,K+会提高抗氧化肽AFYRW的·OH清除率;体外模拟胃肠消化后或者pH值升高都会降低抗氧化肽AFYRW的抗氧化活性;苦荞抗氧化肽AFYRW对红细胞无溶血作用。综上苦荞抗氧化肽AFYRW具有良好的抗氧化活性,对红细胞无溶血作用,在生产和储存过程中,应避免过碱、接触Ca^(2+)。

不同方法提取苦荞蛋白的体外抗氧化活性研究

[目的]研究不同方法提取苦荞蛋白的体外抗氧化活性。[方法]以贵州威宁种植的苦荞为材料,通过蛋白质含量测定、清除羟基自由基能力测定对碱溶酸沉法提取苦荞粗蛋白和Osborne法分级提取苦荞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白进行了比较分析。[结果]通过碱溶酸沉法提取能获得大量的可溶性蛋白,Osborne法提取的蛋白虽然含量较低但获得的种类较多;各种蛋白均具有清除羟基自由基的能力,其清除羟基自由基能力从大到小依次为清蛋白、碱溶酸沉法提取的粗蛋白、谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白。[结论]碱溶酸沉法和Osborne法提取的苦荞蛋白均具有体外抗氧化能力。

人脑胶质瘤组织中趋化因子受体和血管内皮细胞生长因子的表达

目的:探讨趋化因子受体(CXCR7)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)在胶质瘤患者肿瘤组织的表达及其与胶质瘤发生发展的关系。方法:应用组织芯片技术及免疫组织化学SP法,检测10例正常脑组织和69例胶质瘤组织CXCR7和VEGF的表达水平,比较不同病理分级胶质瘤组织中CXCR7和VEGF的表达水平,采用Spearman法分析胶质瘤组织中CXCR7和VEGF的相关性。结果:正常脑组织(对照组)、低级别胶质瘤组及高级别胶质瘤组患者脑组织中CXCR7、VEGF的表达阳性率逐渐升高,组间比较差异有统计学意义(P <0. 05);CXCR7、VEGF表达随胶质瘤恶性程度的增加表达逐渐上调,呈正相关(r=0. 327,P <0. 01); Spearman等级分析显示,CXCR7与VEGF在69例胶质瘤组织中的表达呈正相关关系(r=0. 327,P <0. 01)。结论:CXCR7及VEGF在胶质瘤组织中表达上调,且随着肿瘤恶性程度的增高而增强,CXCR7和VEGF在胶质瘤的发生、发展过程中可能起协同作用。

苦荞活性肽P3对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的改善作用研究

为观察苦荞活性肽P3(P3肽)对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病小鼠的改善作用,该研究采用α-葡萄糖苷酶实验检测苦荞活性肽P3的体外降糖活性;将60只雄性C57/BL6小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组(吡格列酮)及P3肽低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只。除空白组外,其余各组采用高热量饮食喂养4周后,50 mg/kg STZ连续3 d腹腔注射,建立糖尿病动物模型。阳性药物组给予吡格列酮20 mg/kg每日灌胃;P3肽低、中、高剂量组分别给予5、10、20 mg/kg的P3肽,每日腹腔注射。各组均连续给药4周。给药4周后检测口服葡萄糖耐量、空腹血糖、血清甘油三酯(triglyceride,TG)、胆固醇(cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDLC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL-C)。蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测各组小鼠肝组织胰岛素信号通路相关蛋白的表达。结果表明,与模型组相比,P3肽中、高剂量组糖耐量显著改善(P<0.05),呈剂量依赖性;P3肽中剂量组和高剂量组的空腹血糖极显著下降(P<0.01);P3肽各剂量组血清TG、TC、LDL-C含量显著降低(P<0.05),HDL-C含量显著升高(P<0.05);P3肽各剂量组小鼠肝组织中PI3K和GLUT4的表达极显著上调(P<0.01),且呈剂量依赖性。因此,P3肽具有降低糖尿病小鼠血糖血脂、改善胰岛素抵抗的作用。