贵州省蜱种调查及遗传进化分析

为了调查贵州省蜱虫的物种多样性及分布特征,阐明不同地理株蜱虫间的遗传进化关系,试验采用动物体表采集法与布旗法采集寄生蜱及游离蜱;使用超景深显微镜对蜱虫进行形态学鉴定。选取不同地域、种类及不能准确识别的蜱虫提取组织DNA,采用PCR法扩增蜱虫16S rDNA和COI基因片段并测序,通过BioEdit 7.0软件进行多序列比对确认蜱虫物种;使用MEGA 11.0软件对序列信息进行分析,构建基于16S rDNA和COI基因的系统进化树,对不同地理株蜱虫进行遗传进化分析。结果表明:在贵州省8个市州23个区县共采集到蜱虫2 420只,其中牛寄生蜱2 193只,羊寄生蜱92只,犬寄生蜱36只,游离蜱99只。形态学和分子生物学方法共鉴定出2种蜱虫,其中微小扇头蜱1 560只,长角血蜱860只。在系统发育进化中,微小扇头蜱、长角血蜱的16S rDNA和COI基因都分别与对应的参考基因序列聚集成一簇,贵州省大部分微小扇头蜱序列总体上聚于一个分支,只有黔东南州QDNZ1株在两个进化树中都形成了独立分支;多数长角血蜱序列也聚于同一分支,仅基于COI基因构建的系统进化树中毕节市BJS1株与其他省地理株聚在另一分支。说明贵州省家畜常见蜱种为微小扇头蜱和长角血蜱;在贵州省黔东南州存在一株微小扇头蜱特有株系,且在毕节市的长角血蜱存在省外输入的情况,这可能会增加蜱媒疾病在贵州省传播的风险。

SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路促进细胞炎症因子释放

目的:探究SARS-CoV-2辅助蛋白ORF7a介导NF-κB激活,进而诱导炎症因子产生的分子机制。方法:双荧光素酶报告基因试验检测ORF7a对NF-κB激活的影响,qRT-PCR检测ORF7a对细胞中炎症因子表达的影响,Western blot、核质分离及免疫荧光技术检测ORF7a蛋白对p65磷酸化及入核的影响,免疫共沉淀及免疫荧光技术检测ORF7a的作用靶标蛋白。结果:报告基因试验表明ORF7a显著激活NF-κB启动子活性,并呈剂量依赖性(P<0.001),而对AP-1报告基因的激活无明显影响。ORF7a显著上调细胞因子TNF-α、IL-β及IL-8 mRNA表达(P<0.05)。Western blot结果显示ORF7a显著增强p65蛋白磷酸化(P<0.05)及p65的入核(P<0.01)。免疫共沉淀实验发现ORF7a与NF-κB信号通路分子IKKβ蛋白存在相互作用,免疫荧光实验也证实ORF7a与IKKβ具有共定位。结论:SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路,进而促进细胞中炎症因子的释放。

ralb34k2-1刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞对蛋白质PTM代谢物修饰及DENV-2易感性的影响

目的探讨白纹伊蚊唾液蛋白34k2-1(ralb34k2-1)刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)胞内蛋白翻译后代谢修饰(PTMs)的变化及对2型登革病毒(DENV-2)易感性的影响。方法利用抗乙酰化、乳酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和丙二酰化的泛特异性抗体,通过免疫印迹法(Western blot)检测ralb34k2-1蛋白刺激后不同时相的RAW264.7细胞蛋白质翻译后代谢物修饰的情况,酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞内外的乳酸含量;用2 mg/L ralb34k2-1预处理RAW264.7细胞24 h后、继续培养2 d、再用DENV-2感染细胞,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)检测感染18 h和36 h后的病毒核酸变化,分析ralb34k2-1预处理后对病毒易感性的影响;检测感染前后胞内白细胞介素1β-(IL-1β)、白细胞介素10-(IL-10)、肿瘤坏死因子β-(TGF-β)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1)mRNA的相对表达情况,分析ralb34k2-1预处理对细胞免疫状态及细胞极化的影响。结果胞内不同的代谢物对蛋白质的修饰程度主要表现为乳酰化修饰>乙酰化修饰>琥珀酰化修饰;在时相上,除琥珀酰修饰外,随时间的延长其余代谢物对蛋白质的修饰有增多的趋势,其中以6 h乳酰化修饰最多;ralb34k2-1刺激对细胞的乳酸产生无明显影响;经ralb34k2-1预处理后胞内DENV-E相对表达量较对照组高5倍以上,IL-10 mRNA的相对表达在感染前后均保持高水平(6~8倍);在感染前iNOS/Arg比值为3.46±1.59,但受ralb34k2蛋白预处理的细胞在感染后表现iNOS表达下调的趋势。结论蚊唾液ralb34k2蛋白可能通过调控PTM代谢物修饰的方式,改变细胞的免疫状态从而增强登革病毒的易感性。

基于RNA-Seq技术分析不同生物被膜形成能力的临床耐药鲍曼不动杆菌基因表达差异

目的了解不同生物被膜形成能力的临床分离耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌菌株(CRAB)基因表达的差异。方法选取8株临床分离CRAB,将生物被膜形成能力强的菌株4、55、78、117号作为强生物被膜(BF)组,将生物被膜形成能力弱的菌株13、177、191、196号作为弱生物被膜(WBF)组,培养两组菌株形成生物被膜,分别提取RNA进行文库构建和转录组测序(RNA-Seq),以鲍曼不动杆菌AB030(NZ_CP009257.1)的基因组作为参考基因组对测序数据进行分析,鉴定差异表达基因(DEGs),并进行基因本体(GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,选取8个DEGs利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序结果。结果RNA样品完整无污染,测序数据错误率为0.03%;BF组与WBF组相比,鉴定到171个DEGs,其中106条基因为上调表达,65条基因为下调表达;这些基因主要涉及DNA结合、膜蛋白、菌毛调控、ATP的合成和分解等;GO分析显示较多基因被注释到生物过程部分,KEGG分析显示DEGs富集到多种物质代谢途径;选取的8个DEGs利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组测序结果趋势一致。结论不同生物被膜形成能力的临床CRAB的基因表达存在差异,多基因和多条信号通路影响生物被膜的形成。

生物被膜态和游离态临床耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌转录组的差异分析

目的了解临床分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)生物被膜态和游离态的转录组差异,探究生物被膜形成的机制。方法从住院病人痰液或血液样本分离CRAB 4、55、78及117菌株,挑取单菌落分别培养生物被膜态菌(A组)和游离态菌(B组),采用Trizol法提取2组细菌核糖核酸(RNA)样本进行转录组测序;使用DESeq软件进行差异表达基因(DEGs)分析,通过GOSeq R软件进行基因本体(GO)富集分析,通过KOBAS软件进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;选择8个DEGs,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证转录组测序分析结果。结果RNA样品完整无污染满足测序要求,测序数据错误率不超过0.03%;A与B组相比鉴定到407个差异基因,其中212条基因为上调表达,195条基因为下调表达,涉及铁的摄取和转运、菌毛合成的调控、生化代谢酶类及转录调节因子等;GO分析显示,GO条目主要富集于分子功能类别和生物过程类别;KEGG分析显示,DEGs富集到硫代谢、ATP结合盒(ABC)转运系统、万古霉素耐药、群体感应及阳离子抗菌肽耐药等多条通路;选取的8个差异基因通过qRT-PCR进行验证,结果与转录组结果趋势一致。结论临床分离的CRAB菌株,其生物被膜态和游离态存在基因表达差异,生物被膜的形成涉及多基因和多信号通路参与。

家蝇酵母双杂交cDNA文库构建和MD14-3-3互作蛋白筛选

【目的】构建家蝇Musca domestica酵母双杂交cDNA文库,筛选MD14-3-3互作蛋白。【方法】以家蝇为研究对象,经mRNA纯化、cDNA初级文库构建、重组pGADT7-DEST构建次级文库,构建酵母双杂交筛选系统,构建pGBKT7-MD14-3-3质粒作为诱饵筛选与MD14-3-3相互作用的蛋白,并进行回转验证。【结果】成功构建文库容量为1.6×10^(7) CFU,重组率为100%的家蝇酵母双杂交cDNA文库。酵母双杂交筛选获得2个靶蛋白,回转试验表明mucin-like protein HKR1与抗菌肽ctenidin-1为MD14-3-3的互作蛋白。【结论】从成功构建的家蝇酵母双杂交cDNA文库中筛选出MD14-3-3蛋白的2个互作蛋白,为进一步探究家蝇免疫应答机制奠定了基础。

基于RNAi的家蝇β-葡萄糖苷酶功能分析

【目的】探明家蝇β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)在家蝇体内的功能,为深入研究家蝇BG在木质纤维素降解中的作用奠定基础。【方法】针对家蝇BG基因的功能结构域设计3对特异性引物用于dsRNA的体外合成,通过显微注射的方法将dsRNA导入家蝇2龄幼虫,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测抑制效率,分别以滤纸、水杨苷、微晶纤维素及羧甲基纤维素钠为底物检测BG基因的干扰对家蝇消化道粗酶液滤纸酶活性、BG、CBH(Cellobiohydrolase)及EG(Endoglucanase)酶活性的影响。【结果】在注射dsRNA后18 h家蝇幼虫消化道中BG基因的表达量下降62%且此时为最佳干扰时间点,在BG基因表达受到抑制后家蝇消化道的滤纸酶、BG酶活性显著降低,且时间变化趋势与上述干扰条件下BG基因表达量变化一致,均在干扰后18 h酶活性达最低,但CBH及EG酶活性较对照组无显著变化。【结论】RNA干扰技术能够有效抑制家蝇BG基因的表达,推测家蝇BG具有滤纸酶和BG酶活性。

抗菌肽Cecropin4与抗生素联合的体外抗菌效果

目的:探究抗菌肽Cecropin4(Cec4)分别与3种抗生素联合使用对鲍曼不动杆菌(AB)的体外抗菌效果。方法:采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽Cec4、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠(SCF)、注射用亚胺培南西司他丁钠(IMP)及注射用硫酸多黏菌素B(PB)单用时对AB的最小抑菌浓度(MIC),运用棋盘法检测抗菌肽Cec4分别与这3种抗生素联用时对AB的抑菌效果,用部分抑菌浓度指数(FICindex)反映抗菌肽Cec4分别与这3种抗生素联用对AB的用药效果。结果:抗菌肽Cec4、SCF、IMP及PB对标准、多重耐药和泛耐药AB时菌株的MIC分别为4、16~64、16~64及0.625mg/L;抗菌肽Cec4与PB联合作用于标准AB时、FICindex为0.50,抗菌肽Cec4分别与3种抗生素联合作用于多重耐药和泛耐药AB时,FICindex范围均在0.5~1.0。结论:抗菌肽Cec4与PB联合使用对标准AB表现为协同作用,抗菌肽Cec4分别与3种抗生素联合对多重耐药和泛耐药AB表现为相加作用。

食物中多不饱和脂肪酸在家蝇幼虫体内的富集与代谢及对其生长的影响

【目的】阐明家蝇 Musca domestica 幼虫对食物中各种多不饱和脂肪酸的富集能力以及代谢转化情况,并探究各种多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。【方法】在基础饲料中添加不同浓度(3%, 6%和12%)的多不饱和脂肪酸(亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸)饲养经过脱脂传代培养的家蝇幼虫;提取家蝇幼虫的总脂肪酸,利用气相色谱仪进行检测和分析;测定统计幼虫体重,以分析多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。【结果】亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在家蝇幼虫体内均能被富集,且它们的富集程度随着食物中多不饱和脂肪酸的添加浓度的升高而增加,其中亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在幼虫体内富集的最高含量(占体内总脂肪酸的比例)分别为21.93%, 16.13%和9.68%,而二十二碳六烯酸不能在家蝇幼虫体内富集,提示家蝇幼虫食物中添加的各种多不饱和脂肪酸经过代谢后并没有在其体内产生新的脂肪酸,而食物中添加的二十二碳六烯酸在家蝇幼虫体内被分解代谢后消除。饲喂α-亚麻酸及花生四烯酸后家蝇幼虫体重增长较为明显,其中6%α-亚麻酸添加组的幼虫体重显著高于对照组(取食脱脂饲料)和3%和12%α-亚麻酸添加组,3%和6%花生四烯酸添加组的幼虫体重显著高于对照组和12%花生四烯酸添加组。【结论】家蝇幼虫体内能够从食物中富集部分多不饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸碳链越长其富集程度越低直至不能富集,富集的多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长有不同程度的影响。

一清颗粒联合环磷酰胺对三阴性乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的影响

目的研究一清颗粒联合环磷酰胺对三阴性乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的影响。方法建立小鼠乳腺癌移植瘤模型,并随机分为阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组,每组8只。阳性对照组腹腔注射30 mg·kg^(-1)·d^(-1)环磷酰胺,实验组灌胃20 g·kg^(-1)·d^(-1)一清颗粒,联用组腹腔注射30 mg·kg^(-1)·d^(-1)环磷酰胺+灌胃20 g·kg^(-1)·d^(-1)一清颗粒。阴性对照组灌胃等体积0.9%NaCl+腹腔注射等体积0.9%NaCl,每天1次,连续干预17天。检测各组小鼠肿瘤生长情况;检测各组小鼠抑瘤率、脾指数和胸腺指数;检测各组中性粒细胞、外周血淋巴细胞和单核细胞的比例;检测肿瘤组织中CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞比例;检测肿瘤组织中IL-6和TNF-αmRNA表达水平;检测各组小鼠体质量增加率。结果联合组移植瘤生长速度最慢;阳性对照组、实验组和联合组抑瘤率分别为60.34%,24.71%和76.46%;阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组的胸腺指数分别为(0.50±0.28)、(0.06±0.04)、(0.54±0.39)和(0.23±0.04);阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组的外周血淋巴细胞比例分别为(33.77±2.29)%、(16.20±4.52)%、(31.33±10.01)%和(21.07±4.37)%;阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组的CD4^(+)T细胞比例分别为(36.43±2.67)%、(33.57±1.69)%、(45.96±3.54)%和(62.8±3.63)%;阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组的CD8^(+)T细胞比例分别为(30.02±1.97)%、(25.79±2.32)%、(34.95±1.93)%和(42.16±2.57)%;阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组的IL-6 mRNA表达水平分别为1.00±0.04、0.67±0.02、0.61±0.04和0.49±0.05;阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组的TNF-αmRNA表达水平分别为1.00±0.03、0.73±0.01、0.69±0.02和0.66±0.03。阴性对照组、阳性对照组、实验组和联合组的体质量增加率分别为(12.50±1.84)%,(5.00±1.63)%,(8.30±0.54)%和(8.10±0.41)%。与阳性对照组相比,联合组抑瘤率、胸腺指数、外周血淋巴细胞比例、CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞比例以及体质量增加率都显著增加,而IL-6的表达水平显著降低(P<0.05)。结论一清颗粒联合环磷酰胺可显著抑制乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤生长,一清颗粒可以减少环磷酰胺致小鼠免疫功能减退的毒性反应,改善生存质量。

家蝇幼虫对两种秸秆的消化及利用研究

本文旨在探明家蝇Musca domestic幼虫对高粱秸秆和小麦秸秆营养成分利用和木质纤维素的降解情况,以及不同配比秸秆饲料对家蝇生物学指标的影响,为今后产业化利用家蝇来生物降解秸秆类有机废弃物奠定理论基础。本研究采用70%高粱秸秆粉、70%麦秸秆粉和纯麦麸作为饲料,每种饲料各设置对照组、发酵组和家蝇幼虫取食组3种处理,检测并分析3种饲料各处理组中一般营养成分和木质纤维素的含量及变化;同时采用7种配比饲料喂养家蝇,观察各组家蝇不同发育阶段的体长、体重、存活率和发育历期等。结果表明:(1)3种饲料的各处理组中,一般营养成分和木质纤维素的含量均呈现:对照组>发酵组>家蝇取食组的趋势,此外除高粱秸秆组粗蛋白外,其余各组成份均差异显著(P<0.05);(2)小麦秸秆的木质纤维素含量>高粱秸秆>麦麸,且各组间均差异显著(P<0.05);(3)在相同秸秆配比条件下,高粱秸秆饲喂的家蝇其各虫态体长、体重、总存活率和发育历期均要优于麦秸秆喂养,且总存活率和发育历期与麦麸喂养相比差异不显著(P>0.05);(4)纯高粱秸秆喂养下家蝇仍能保持正常的生长发育,而在90%小麦秸秆喂养下,家蝇则无法存活。综上所述,家蝇适合作为生物转化器用于秸秆、尤其是高粱秸秆的降解,且降解效果优于单纯的微生物发酵降解,研究结果为今后规模化利用家蝇降解秸秆类有机废弃物提供了理论依据和科学基础。

家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin15的克隆表达及重组蛋白的体外活性分析

为探明家蝇重组Serpin15蛋白的体外活性和酶稳定性,本文对家蝇Serpin15基因进行了生物信息学分析和克隆表达,并对纯化后的家蝇重组Serpin15蛋白进行了酶特性的研究。结果显示:家蝇Serpin15基因ORF框全长为1353 bp,编码450个氨基酸,理论分子量为51076.63 Da,有信号肽和一个标志抑制活性的功能结构域RCL反应环;成功构建原核表达载体pET-28a(+)-Serpin15,经诱导表达和纯化获得家蝇重组Serpin15蛋白;重组蛋白酶特性研究发现,家蝇重组Serpin15蛋白对胰蛋白酶有极显著的抑制作用,此外,将重组Serpin15蛋白经20~60℃热处理15 min,或经pH 6~10过夜处理,或经50℃和pH 8处理后室温存放15~90 min,重组蛋白的胰蛋白酶抑制活性均仍大于70%。研究结果为家蝇Serpin15蛋白的免疫功能研究奠定了重要实验基础,也为有害昆虫杀虫剂的研发提供思路。

白纹伊蚊唾液rAlb-34k2蛋白可黏附大肠杆菌并抑制其生长

目的:探讨重组的白纹伊蚊唾液特异性34k2蛋白(rAlb-34k2)黏附大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的可能,及其对大肠杆菌OD600值的影响。方法:利用细菌结合实验,通过Western blot方法检测rAlb-34k2蛋白与大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的黏附效应,用分光光度计法检测不同浓度的rAlb-34k2蛋白对24 h内大肠杆菌OD600值的影响。结果:可在7%SDS处理后的大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌的细菌上清液、菌体沉淀和7%SDS处理的铜绿假单胞菌上清液中检测到rAlb-34k2蛋白,而在处理的乙型溶血性链球菌上清液及其菌体沉淀中未检测到相应的蛋白条带。不同浓度的rAlb-34k2蛋白(16~137 ng/μl)处理后大肠杆菌在12 h的OD600显著低于细菌对照组(P<0.05),其中以高浓度(137 ng/μl、112 ng/μl)的蛋白处理组细菌OD600值下降最为显著,且该现象与Ca^2+无关。此外,同源的rAalb-CTL2蛋白(重组白纹伊蚊唾液CTL2蛋白)在Ca^2+依赖下具有诱导大肠杆菌OD600增高的现象。结论:白纹伊蚊雌蚊唾液特异性rAlb-34k2蛋白可与多种细菌黏附,且可能具有抑制大肠杆菌的作用。

家蝇漆酶2基因的克隆及序列特性与表达分析

【目的】探明家蝇漆酶2(Lac-2)基因序列特性及表达,为深入研究家蝇漆酶的生物学功能奠定基础。【方法】通过PCR扩增家蝇Lac-2基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;以GAPDH为内参基因,采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术检测Lac-2基因在家蝇不同发育时期及家蝇3龄幼虫脂肪体、唾液腺、前肠、中肠及后肠中的表达特征。【结果】成功克隆家蝇Lac-2基因的cDNA序列,全长为885 bp,编码269个氨基酸,成熟肽编码蛋白的理论分子量为25 kDa,等电点为7.19。时空表达模式分析显示,Lac-2基因在家蝇3龄幼虫中的表达量最高,在家蝇3龄幼虫的各主要组织中以脂肪体为参照,Lac-2基因在中肠表达水平最高,其次是唾液腺及后肠。【结论】克隆得到家蝇木质素酶Lac-2基因,其功能可能与家蝇的生长发育及食物消化相关。

驱动蛋白Kif5b对人脐静脉内皮细胞血管形成的作用

目的 探讨驱动蛋白Kif5b对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成的作用。方法 以人Kif5b基因序列为模板设计小发夹RNA(sh RNA)序列,同时设阴性对照sh RNA,均以p LL3.7慢病毒包装系统包装sh RNA,随后感染HUVECs敲减Kif5b蛋白,最后将Kif5b敲减的HUVECs作为Kif5b实验组,阴性对照组作为Kif5b对照组;采用Western blot实验检测2组HUVECs中Kif5b的表达,采用细胞成管实验和细胞划痕实验分别检测2组HUVECs的细胞成管率和细胞迁移速度。结果 Kif5b实验组HUVECs的Kif5b表达较Kif5b对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05);Kif5b实验组HUVECs细胞成管率明显低于Kif5b对照组,差异有高度统计学意义(P<0.000 1);Kif5b实验组HUVECs细胞迁移速度明显低于Kif5b对照组,差异有高度统计学意义(P<0.000 1)。结论 在体外实验中,驱动蛋白Kif5b能够正向调控HUVECs血管形成。

贵州省不同地理株中华按蚊mtDNA-COⅠ基因遗传多态性分析

目的了解贵州省不同地理株中华按蚊种群线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA-COⅠ)基因序列的多态性,探讨其遗传多样性、遗传分化和种群扩张情况以及遗传距离与地理距离及其相关关系等种群遗传特征。方法于2017年7月-2018年8月采用灯诱法在贵州省东、西、南、北、中5个方位的12个采样点采集稻田周边的成蚊,经过形态学确认为中华按蚊后,用试剂盒法提取单只蚊虫DNA样本并对mtDNA-COⅠ基因扩增后测序,测序结果用DNAStar 5.0软件进行拼接,在美国国立生物技术信息中心经BLAST比对进行蚊种的分子鉴定,对确认为中华按蚊mtDNA-COⅠ的基因序列使用DnaSP 5.1软件分析其单倍型多样性、核苷酸多样性,并计算各种群间分化系数(Fst)和基因流(Nm)大小,进行中性检验,以明确各种群之间的分化程度和种群扩张情况。使用MEGA 7.1软件计算各种群间和种群内的遗传距离,判断种群之间的遗传变异程度;根据采样点经纬度计算种群间的地理距离,与对应的遗传距离进行相关性检验,以分析两者的相关关系。结果经分子生物学鉴定,共获得贵州省12个地理株中华按蚊mtDNA-COⅠ基因序列551条,长度为709 bp,其中,碱基(A+T)和(G+C)平均含量分别为68.57%和31.43%,709个位点中保守位点有586个,变异位点有123个,单态位点有189个,简约性信息位点有278个,无插入和缺失位点。551条序列共检出329种单倍型,单倍型多样性指数为0.992,核苷酸多样性为0.01522以上,12个种群的Fst值在0.0008~0.4207,Nm值在0.0861~75.2392,中性检验统计值均为负值,种群内遗传距离范围在0.0071~0.0529,种群间的遗传距离范围在0.0079~0.0522,织金种群和都匀种群内遗传距离较其他种群大;遗传距离和地理距离之间无相关关系,不同种群之间可能存在一定的地理隔离,但种群之间遗传距离的大小与地理距离不相关。结论贵州省不同地理株中华按蚊种群遗传多样性丰富,在历史上经历了区域性的种群扩张,可能存在一定程度的遗传分化和地理隔离,但在一定范围内种群间也有基因交流,呈现出交流与隔离并存的分布格局。

贵州白纹伊蚊感染沃尔巴克氏体以及WO噬菌体的初步调查

目的了解贵州白纹伊蚊种群中沃尔巴克氏体(Wolbachia)以及WO噬菌体的感染情况。方法于2017年在贵州省贵阳市、都匀市、铜仁市、凯里市、遵义市、兴义市、贵安新区、毕节市采用勺舀法采集白纹伊蚊幼虫标本,实验室饲养至成蚊。提取雌蚊基因组DNA,PCR扩增沃尔巴克氏体表面蛋白基因(Wolbachia surface protein,wsp)和WO噬菌体衣壳蛋白的核糖体S7基因(Ribosomal S7 gene,orf7)。分别从8个地区的阳性检测标本中随机选取10个样品进行测序,使用DNAStar 7.0软件分析基因的基本特征;采用MEGA 4.0软件对所获基因序列进行分析比对,并构建系统进化树;采用SPSS 20.0软件对WO噬菌体侵染wAlbA、wAlbB株沃尔巴克氏体的检测结果进行关联性分析。结果贵州省8个地区的白纹伊蚊wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体超感染率为84.30%(322/382),wAlbA株、wAlbB株沃尔巴克氏体单感染率分别为4.97%(19/382)和3.66%(14/382),WO噬菌体的感染率为76.44%(292/382)。通过测序获得沃尔巴克氏体的wsp序列,其中wAlbA株(379 bp)80条,wAlbB株(501 bp)78条;获得WO噬菌体的orf7序列(263 bp)73条。比对分析显示贵州省8个地区获得所有wAlbA株、wAlbB株的wsp序列、orf7序列的同源性均为100%。确切概率法分析WO噬菌体侵染与wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体超感染有关联性(P<0.05)。结论贵州白纹伊蚊种群普遍感染WO噬菌体和沃尔巴克氏体,且以超感染wAlbA和wAlbB株沃尔巴克氏体为主。WO噬菌体主要侵染的对象是超感染wAlbA和wAlbB株的沃尔巴克氏体。

白纹伊蚊自噬基因ATG8蛋白多克隆抗体的制备及应用

目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR鉴定,提取质粒进行测序鉴定。再将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白rAa-ATG8,纯化透析后免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体效价,并以该抗体为一抗采用Western blot检测不同物种ATG8蛋白的表达。结果成功构建原核表达载体PET30a-AaATG8并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其血清抗体效价为1∶640000;Western blot显示rAa-ATG8多克隆抗体可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,反应条带位于18、16或14 ku处。结论成功获得高效价的rAa-ATG8多克隆抗体,该抗体不仅可用于检测白纹伊蚊ATG8蛋白,还可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,为研究自噬在蚊虫以及其他物种中的作用奠定了基础。

抗菌肽AMP-17抗白念珠菌作用靶点鉴定

白念珠菌(Candida albicans)是侵袭性真菌感染的主要致病性病原体。抗菌肽AMP-17有较强的抗念珠菌活性,经AMP-17作用白念珠菌后的蛋白组学结果显示,细胞壁(XOG1)和氧化应激(SRR1)蛋白基因表达差异显著,提示AMP-17可能通过影响XOG1和SRR1基因发挥其抗白念珠菌作用。为进一步探究XOG1和SRR1基因是否为AMP-17的作用靶点,本研究利用规律成簇间隔短回文重复序列相关蛋白9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats-associated protein 9,CRISPR/Cas9)系统构建了白念珠菌xog1Δ/Δ和srr1Δ/Δ缺失菌;表型观察结果发现除XOG1基因缺失可影响白念珠菌的体外应激和菌丝形成,2个基因缺失对白念珠菌生长繁殖和生物膜形成无明显影响;药敏实验分析显示AMP-17对xog1Δ/Δ和srr1Δ/Δ缺失菌的MIC80值从野生菌的8μg/mL增至16μg/mL,而对srr1Δ/Δ::srr1回补菌的MIC80值降至野生菌水平。此外,AMP-17抑制2株缺失菌生物膜形成的能力均较野生菌明显降低,表明缺失菌在酵母态及生物膜形成过程中对AMP-17的敏感性均降低,提示XOG1和SRR1基因可能是AMP-17发挥抗白念珠菌的潜在靶点。本研究结果为进一步探讨新型肽类抗真菌药物的抗菌机制提供了一定的实验依据和基础。

白纹伊蚊胰岛素样肽基因的鉴定和时空表达分析

目的筛选并鉴定白纹伊蚊全基因组中的胰岛素样肽(insulin-like peptides,ILP)基因,分析其基因结构以及在不同发育时期和不同组织的表达谱。方法基于埃及伊蚊ILPs家族成员序列,在Vectorbase网站上的白纹伊蚊全基因组数据库做同源搜索,SignalP 6.0进行信号肽预测,MEGA 11.0软件包对ILPs基因结构特点进行分析,最大似然法构建系统进化树。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同发育时期(卵、4龄幼虫、蛹、成蚊),以及吸血前后雌蚊不同组织(头部、脂肪体、中肠、胸部、卵巢)的白纹伊蚊胰岛素样肽(insulin-like peptides of Aedes albopictus,AalbILPs)基因表达变化。采用SPSS 20.0软件做数据统计分析,Tukey’s HSD检验和t检验分析不同发育时期和吸血前后不同组织中AalbILPs基因的表达差异。结果在白纹伊蚊全基因组中获得7条ILPs开放阅读框序列。7条AalbILPs序列均具有胰岛素超家族的保守特征,由连续的信号肽、B、C和A链组成前肽。其中AalbILP6具有截短的C链和羧基末端延伸,类似脊椎动物的胰岛素生长因子。系统进化树显示,AalbILP1、2、3和5在蚊虫中最为保守,AalbILP6其次,而AalbILP4、7为伊蚊所特有。qRT-PCR结果显示,AalbILP1、2、3和5在不同发育阶段均有表达。AalbILP5在雄蚊中相对表达量为1.3583±0.5769,与其他发育阶段和雌蚊相比最高(q_(卵)=6.572,q_(幼虫)=5.771,q_(蛹)=5.409,q_(雌蚊)=3.115,均P<0.05)。AalbILP3和4在成蚊头部特异性表达,AalbILP6主要在雌蚊卵巢表达;AalbILP7为假基因,未转录。与未吸血蚊虫相比,吸血诱导AalbILP3和4在雌蚊头部的表达分别上调2.60和1.68倍(t_(AalbILP3-头部)=9.596,P_(AalbILP3-头部)<0.001;t_(AalbILP4-头部)=4.524,P_(AalbILP4-头部)=0.001);AalbILP1在头部、脂肪体以及中肠的表达分别上调10.33、6.07和3.79倍(t_(头部)=4.255,P_(头部)=0.001;t_(脂肪体)=4.305,P_(脂肪体)=0.001;t_(中肠)=10.480,P_(中肠)<0.001),胸部和卵巢的表达分别下调4.24和2.17倍(t_(胸部)=7.922,P_(胸部)<0.001;t_(卵巢)=3.752,P_(卵巢)=0.003);AalbILP6在雌蚊中肠和卵巢的相对表达量分别上调11.91和2.16倍(t_(中肠)=5.799,P_(中肠)<0.001;t_(卵巢)=9.074,P_(卵巢)<0.001)。结论在白纹伊蚊全基因组中共获得6条ILPs序列,并成功构建其时空表达谱。