燃煤污染型氟中毒病区儿童智力调查及法医学意义

目的探讨燃煤污染型氟中毒病区8～12岁儿童智力水平及其与染氟量之间的关系,为慢性氟中毒致中枢神经损伤的相关研究提供人群数据资料,为氟病区人群智力残疾鉴定提供修正参考值。方法采用《中国修订韦氏学龄期儿童智力量表(WISC-CR)》测试99名8～12岁小学生(包括氟斑牙组55人,对照组44人)的智力水平,比较氟斑牙组与对照组儿童智力水平差异,并对染氟儿童智力水平与染氟量之间的相关性进行分析。结果氟斑牙组的言语智商(85.64±16.53)、操作智商(94.87±12.73)、总智商(88.51±12.77)均低于对照组(言语智商94.34±16.04、操作智商99.23±12.44、总智商96.64±11.70),其中,两组的言语智商和总智商差异有统计学意义(P=0.002,P=0.01)。氟斑牙组与对照组的言语智商中各项分测验均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。操作智商中各项分测验除积木测验和译码检测外,差异有统计学意义(P<0.05)。结论燃煤污染型氟中毒儿童可出现智力损害,对言语智力的损伤较为明显;对患儿进行智力残疾鉴定时,应考虑修正智力评测的结果。

甲基苯丙胺对体外培养SH-SY5Y细胞线粒体膜电位、超微结构及Mfn1、Fis1蛋白表达的影响

目的 评估甲基苯丙胺(METH)对体外培养的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位(MMP)、线粒体超微结构及Mfn1、Fis1蛋白表达的影响。方法 SH-SY5Y细胞中加入METH(0.0、1.0、1.5、2.0 mmol·L^-1 ),培养3、6、12、24 h;JC-1法检测SH-SY5Y细胞MMP;透射电镜观察SH-SY5Y细胞线粒体超微结构;Western blot检测Mfn1、Fis1蛋白表达。结果 METH作用SH-SY5Y细胞3、6、12、24 h,与对照组比较,METH组细胞MMP红绿荧光比值明显降低( P <0.05),Mfn1蛋白表达降低( P <0.05),Fis1蛋白表达升高( P <0.05);METH作用SH-SY5Y细胞24 h时,透射电镜观察见未处理组细胞线粒体呈椭圆形棒状双层膜结构,线粒体嵴正常、清晰,METH组细胞线粒体椭圆形棒状结构被分裂成小球状结构,并发现线粒体自噬小体及自噬溶酶体。结论 METH可引起SH-SY5Y细胞MMP下降、线粒体超微结构改变及Mfn1、Fis1蛋白表达水平改变,其改变可能参与METH致神经细胞损伤的发病机制。

沉默Fis1基因对METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞增殖能力、线粒体膜电位和超微结构的影响

目的评估线粒体分裂蛋白1(Fis1)在甲基苯丙胺(METH)诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)损伤中的作用。方法采用成组设计方法,将体外培养SH-SY5Y细胞分为不同组别:未沉默组、沉默阴性组和沉默组,不同浓度的METH诱导各组SH-SY5Y细胞24 h。利用Western blot检测Fis1蛋白表达水平,使用CCK-8细胞毒性增殖实验分析METH对SH-SY5Y细胞增殖能力的影响,利用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测METH对SH-SY5Y细胞MMP水平的影响,使用透射电镜观察METH对SH-SY5Y细胞线粒体超微结构的影响。结果未沉默组、沉默阴性组和沉默组中,与对照组比较,各组组内随METH诱导SH-SY5Y细胞的浓度升高,Fis1蛋白表达水平升高(P<0.05)、增殖能力减弱(P<0.05)、MMP水平降低(P<0.05);与未沉默组和沉默阴性组相同浓度比较,沉默组SH-SY5Y细胞Fis1蛋白表达水平降低(P<0.05),增殖能力增强(P<0.05),MMP水平升高(P<0.05)。组内与对照组比较,2.0mmol·L^-1 METH诱导未沉默组、沉默阴性组和沉默组,透射电镜观察见线粒体小球状结构增多(P<0.01)。结论Fis1可能在METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞损伤中起关键作用。

二十二碳六烯酸对甲基苯丙胺诱导的人神经母细胞瘤细胞神经毒性的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)对甲基苯丙胺(METH)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞神经毒性的作用及其作用机制。方法体外培养SH-SY5Y细胞,分为Control组、METH组以及METH+DHA组。显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态,测量并计算细胞长轴和短轴的比值,通过流式细胞术检测各组SH-SY5Y细胞凋亡水平。采用蛋白质组学分析METH引起的SH-SY5Y蛋白组改变,并筛选加入DHA后表达回调的蛋白。结果与Control组比较,METH组SH-SY5Y细胞神经突明显短缩,长轴与短轴比值减小(均P<0.05);与METH组比较,METH+DHA组神经突伸长,细胞长轴与短轴比值增大(均P<0.05)。与Control组比较,METH组早期细胞凋亡和晚期细胞凋亡比例升高,且总凋亡细胞比例也明显升高(均P<0.05);与METH组比较,METH+DHA组晚期细胞凋亡和总凋亡细胞比例降低(均P<0.05)。蛋白组学分析显示,加入DHA可以将22个METH诱导下表达变化的蛋白反向调节,涉及了核糖体、细胞骨架和谷胱甘肽代谢等生物学功能。结论DHA可减弱METH诱导的SH-SY5Y细胞神经毒性,其机制可能与DHA调控角蛋白表达,改善谷胱甘肽代谢等信号通路有关。

染氟对人脑神经母细胞瘤细胞线粒体融合蛋白1和分裂蛋白1表达与膜电位的影响

目的评估氟对体外培养的人脑神经母细胞瘤细胞株（SH．SY5Y细胞）线粒体膜电位和线粒体融合蛋白1（Mfn1）、分裂蛋白1（Fis1）表达的影响。方法在SH．SY5Y细胞中加入0．0（对照）、0．4、2．0、4．0mmol／L氟化钠（NaF），培养6、12、24、48h；利用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）对SH．SY5Y细胞线粒体膜电位进行染色；使用蛋白免疫印迹法（Westem Blot）检测线粒体Mfn1和Fis1蛋白的表达。结果NaF作用6、12、48h时，与对照组（1．63±0．18、1．13±0．15、1．30±0．02）比较．2．0、4．0mmol／L NaF处理组SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的红绿荧光比值（1．01±0．10、0．80±0．04，0．75±0．13、0．62±0．10，0．82±0．01、O．56±0．04）明显降低（P均〈0．05）；NaF作用6、12、48h时，与对照组（O．93±0．03、1．05±0．07、1．17±0．04）比较，0．4、2．0、4．0mmol／L NaF处理组Mfn1蛋白的表达（0．75±0．02、0．65±0．05、0．57±0．06，0．83±0．06、0．79±0．06、0．69±0．06，0．98±0．05、0．73±0．07、0．62±0．09）明显降低（P均〈0．05）；NaF作用12h时，与对照组（0．90±0．05）比较，2．0、4．0mmol／L NaF处理组Fis1蛋白表达（1．14±0．06，1．23±0．06）明显升高（P均〈0．05）。结论氟中毒损伤可引起神经细胞线粒体融合分裂水平改变并致线粒体膜电位下降，其改变可能与高氧化应激发病学说相关。

甲基苯丙胺对SH-SY5Y细胞PINK1/Parkin介导的自噬流及凋亡影响

目的观察甲基苯丙胺(METH)对SH-SY5Y细胞PINK1/Parkin介导的线粒体自噬的作用,探讨自噬流进程及对细胞凋亡的影响。方法在体外培养的SH-SY5Y细胞中加入含不同浓度的METH(0.0、1.0、1.5、2.0 mmol/L)培养基,诱导24 h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况;透射电镜观察线粒体自噬现象;激光共聚焦显微镜观察溶酶体吞噬线粒体活性;Western bolt检测自噬标志蛋白LC3和P62及自噬调节蛋白PINK1和Parkin表达水平。结果METH诱导SH-SY5Y细胞24 h后,SH-SY5Y细胞凋亡水平与METH剂量呈正相关(P<0.05);线粒体超微结构破坏严重,数量减少,出现自噬小体,溶酶体数量增加,吞噬线粒体活性增强(P<0.05);LC3-II/LC3-I比值上升(P<0.05),P62蛋白早期表达水平不变,48 h后表达量下调(P<0.05);Parkin蛋白表达量升高,PINK1蛋白表达量无明显变化。结论METH通过诱导PINK1/Parkin信号通路介导了线粒体自噬,其自噬流通畅,自噬流末端反馈迟滞,可能与SH-SY5Y细胞凋亡有关。

氟对斑马鱼骨骼发育的影响及与OPG/RANKL通路的相关性研究

目的探究氟暴露对斑马鱼幼鱼骨骼发育的影响,并探索其可能的分子机制。方法选择受精后6 h(6 hpf)野生型斑马鱼胚胎,采用氟化钠[NaF,对照组(0 mg/L NaF)、低氟组(25 mg/L NaF)和高氟组(100 mg/L NaF)]暴露至9 d。使用氟离子选择电极法检测斑马鱼幼鱼的整体氟含量,观察并统计斑马鱼幼鱼的死亡及发育情况,采用茜素红染色和阿尔新蓝染色分别分析斑马鱼幼鱼的骨矿化和软骨形成情况,实时荧光定量PCR法分析sry相关高迁移率组盒9(Sox9)的同源基因Sox9a、骨保护素(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达情况。结果与对照组[(0.12±0.01)μg/140条]比较,低氟组[(0.28±0.03)μg/140条]和高氟组[(0.64±0.10)μg/140条]斑马鱼幼鱼整体氟含量均较高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与对照组比较,高氟组斑马鱼幼鱼体长较短、鱼鳔发育缺失率和脊柱弯曲率均较高(P均<0.05);低氟组茜素红染色骨矿化面积、累计光密度(IOD)和矿化椎骨数均较高,阿尔新蓝染色软骨形成面积较低(P均<0.05);高氟组茜素红染色骨矿化面积、IOD和矿化椎骨数均较低,阿尔新蓝染色软骨形成面积较高(P均<0.05)。与对照组比较,低氟组OPG mRNA表达水平和OPG/RANKL比值均较高(P均<0.05);高氟组RANKL mRNA表达水平较高,OPG/RANKL比值较低(P均<0.05)。结论斑马鱼胚胎至幼鱼时期给予短时间的氟暴露即可造成斑马鱼幼鱼骨骼发育异常,该影响可能与软骨内成骨和OPG/RANKL通路相关。