贵州发酵酸汤中携带真菌病毒的酵母菌筛选

为携带真菌病毒的酵母在贵州酸汤中调节微生物平衡提供参考,了解贵州省特色食品红、白酸汤中的酵母菌及其携带真菌病毒的携带率和多样性,从贵州发酵的红、白酸汤中分离和鉴定酵母菌菌株,并且检测其是否携带真菌病毒。通过YEPD固体培养基培养分离出疑似酵母菌单菌落,经ITS鉴定菌株种类后,再通过CF-11纤维素粉分离法检测是否携带真菌病毒,从而初步评估贵州省特色食品红、白酸汤中的酵母菌种类及其携带真菌病毒的携带率及其多样性。最后用甘油保存法保存目的菌株。结果表明:筛选鉴定酵母菌株47株,其中37株携带真菌病毒(均已进行菌种保存),占比约为79%。

稻曲病菌菌株GZ-14-07中携带的全病毒基因组特征研究

稻曲病菌是引起真菌类病害水稻稻曲病的病原。从稻曲病菌菌株GZ-14-07中分离到一株真菌病毒,命名为Ustilaginoidea virens RNA virus 6(UvRV6),对其进行了序列分析。通过CF-11纤维素粉法提取菌株GZ-14-07中的真菌病毒UvRV6,采用随机引物扩增法获得UvRV6的全长基因组序列,使用DNAMAN、BlastP和MEGA等软件对UvRV6的全长序列进行拼接、比对和系统进化树分析。研究发现UvRV6全基因组长度为5043个碱基,GC为48.8%,UvRV6基因组序列中存在两个开放阅读框(ORF1和ORF2),ORF1长2280个碱基,编码760个氨基酸(79.6 kD),ORF2长2385个碱基,编码830个氨基酸(91.5 kD)。ORF1和ORF2编码的蛋白,分别与全病毒科维多利亚属真菌病毒成员的衣壳蛋白和依赖于RNA的RNA聚合酶显著出较高的相似性。另外,UvRV6的ORF1和ORF2之间有一个AUGA序列,在AUGA序列上游存在一段能形成一个H型的假节序列,这两个序列元件的存在使UvRV6两个开放阅读框(ORF1和ORF2)能通过翻译终止后又重新启动翻译的机制,融合成一个大的开放阅读框。最后,通过UvRV6和其他全病毒科成员的依赖于RNA的RNA聚合酶蛋白序列构建的系统进化树分析得出,UvRV6与属于全病毒科维多利亚属的成员聚集成一簇。明确了UvRV6属于全病毒科维多利亚属的新成员。

Rhodosporidiobolus odoratus菌株GZ2017中真菌病毒的分离和鉴定

为Rhodosporidiobolus odoratus菌株中病毒的鉴定提供参考,从Rhodosporidiobolus odoratus菌株GZ2017中,分离真菌病毒Rhodosporidiobolus odoratus Totivirus 1(RoTV1);获取并解析真菌病毒RoTV1的全长基因组序列;明确真菌病毒RoTV1的病毒学分类学地位。采用随机引物法扩增病毒的全长序列;使用接头引物扩增法获取病毒末端序列;获取的病毒片段通过DNAMAN软件进行拼接;序列同源性搜索使用NCBI网站的在线BLAST程序;使用MEGA7.0软件进行系统进化树的构建。结果表明:成功分离新型真菌病毒RoTV1,其携带3条病毒条带,分别为dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3。获得RoTV1的全长基因组序列,其中,dsRNA1序列分析显示具有2个不连续的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),即ORF1和ORF2。ORF1和ORF2分别跟全病毒科(Totiviridae)全病毒属(Totivirus)真菌病毒编码的外壳蛋白(Coat Protein,CP)和RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)具有较高的相似性。ORF1和ORF2之间间隔92个碱基。ORF2有可能通过1个由移码序列(GGAUUUU)启动的-1核糖体移码机制跟ORF1融合成1个大的融合蛋白。对dsRNA2和dsRNA3序列进行分析,未发现编码有意义的大ORF,无已知的蛋白质与dsRNA2和dsRNA3具有序列相似性。此外,dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3在菌株GZ2017中非常稳定和相互依赖,推测dsRNA2和dsRNA3可能是dsRNA1的卫星RNA(SatRNA)。另外,基于RoTV1的RdRp和CP序列进行的系统发育分析表明,RoTV1属于Totiviridae科Totivirus属的新成员。

棘孢木霉菌携带真菌病毒TaUV1的分离与鉴定

为棘孢木霉菌株(Trichoderma asperellum)中病毒的鉴定提供参考,在棘孢木霉菌株中分离到真菌病毒Trichoderma asperellum Unassigned Virus 1 (TaUV1);对其全长基因组序列进行了分析,明确真菌病毒TaUV1的病毒分类学地位。采用随机引物扩增法获得TaUV1的全长基因组序列,使用DNAMAN、BlastP和MEGA等软件对TaUV1的全长序列进行拼接、比对和系统进化树分析。结果表明:真菌病毒TaUV1携带1条病毒条带,其基因组长度为9 838bp,GC含量为47.8。经序列分析显示,具有2个不连续的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),即ORF1和ORF2。ORF1长4 509bp,编码假定蛋白(Hypothetical protein,HP);ORF2长3 984bp,编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)。ORF1和ORF2之间间隔113个碱基,在ORF1终止密码子TAA的5 684~5 686bp发现了1个移码序列七聚体(AAAAAAT),在此处发生了程序性-1的核糖体移码机制,使2个ORFS被通读,编码1个融合蛋白。基于TaUV1的RdRp序列进行的系统发育分析得知,TaUV1属于Unassigned Virus科的新成员。

稻曲病菌菌株GZ-2中携带的病毒基因组特征

稻曲病菌是引起真菌类病害水稻稻曲病的病原。从稻曲病菌菌株GZ-2中分离到1株真菌病毒,命名为Ustilaginoidea virens Unclassified virus 2(UvUV2),对其进行了序列分析。通过CF-11纤维素粉法提取菌株GZ-2中的真菌病毒UvUV2,采用随机引物扩增法获得UvUV2的全长基因组序列,使用DNAMAN、BlastP和MEGA等软件对UvUV2的全长序列进行拼接、比对和系统进化树分析。结果表明:UvUV2全基因组长度为2 887bp,GC含量为58.8%,UvUV2基因组序列中存在2个重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2)。ORF1长561bp,编码186个氨基酸(20.06kDa),编码1种未知蛋白;ORF2长2 394bp,编码797个氨基酸(89.42kDa),编码依赖于RNA的RNA聚合酶。ORF2编码的蛋白与Purpureocillium lilacinum nonsegmented virus 1(PINV-1)RNA的RNA聚合酶关系最密切。另外,UvUV2病毒基因组序列中发现1个类似甲型流感病毒基因组中的滑动序列(CCC_UUU_UAG),使得UvUV2的ORF1和ORF2通过+1移码机制形成融合蛋白。通过UvUV2的依赖于RNA的RNA聚合酶蛋白序列构建的系统进化树分析得出,UvUV2是一种未分类的真菌病毒。综上所述,UvUV2属于一个未分类的科。

前列腺干细胞抗原及其单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达与检测

扩增前列腺干细胞抗原(PSCA)及其特异单链抗体PaFv的编码基因,分别克隆到pET-32a和pDAP2/S载体中,转化大肠杆菌感受态细胞。融合蛋白TrxA-PSCA和PaFv-AP诱导表达后,SDS-PAGE和Westernblot分析其表达情况,碱性磷酸酶(AP)显色反应和ELISA检测蛋白的活性。结果显示构建的原核表达体系成功实现TrxA-PSCA和PaFv-AP融合蛋白的可溶性表达,而且PaFv-AP具有与PSCA抗原结合的抗体活性以及AP活性。

基于不同乳酸菌发酵的黄秋葵酸奶研制及其体外抗氧化研究

以纯牛奶为主要原料,通过添加黄秋葵原汁,利用不同乳酸菌发酵,研制一种具有保健功能的黄秋葵酸奶。以感官评分评价标准,以不同乳酸菌种、白砂糖添加量、发酵时间、黄秋葵汁添加量因素进行单因素试验,并用正交试验优化葵酸奶的最佳制备工艺,结果显示,由植物乳杆菌发酵的酸奶,在5%白砂糖、6%黄秋葵原汁,发酵时间4 h的工艺条件下,得到酸奶品质最好,并具有较显著的抗氧化能力。

埃及伊蚊腺苷脱氨酶相关基因的鉴定和表达分析

为了筛选和鉴定埃及伊蚊全基因组中腺苷脱氨酶相关基因，并分析其在蚊虫不同发育时期、雌蚊不同组织中的表达差异，本文运用模式昆虫黑腹果蝇Dm-ADA基因的ADA结构域序列在NCBI埃及伊蚊全基因组数据库中筛选并鉴定埃及伊蚊ADA相关基因，采用ExPASy在线相关工具包分析其理化性质和结构域，运用SignalP4．0预测信号肽，结合使用GeneDoc和Mega6．0软件包进行同源性比对和构建系统进化树构建。首先提取埃及伊蚊不同发育时期（卵、I～Ⅳ龄幼虫、蛹、未吸血雌蚊、雄蚊）、雌蚊不同组织（唾液腺、中肠、脂肪体和卵巢）RNA并逆转录为cDNA，利用荧光实时定量PCR（qRT—PCR）方法对埃及伊蚊不同发育时期和雌蚊不同组织表达谱进行相对定量分析。结果显示，从埃及伊蚊全基因组中获得3条具有完整开放阅读码框的ADA相关基因（Aa-ADAL、Aa-ADGF-A、Aa-ADGF-B）；尽管不同物种ADA基因家族成员间相似性较低，但8个酶活性位点高度保守。Aa-ADAL在2龄幼虫期（7．88）、卵巢（8．05）高表达；Aa-ADGF-A在3龄幼虫期（7．25）高表达；Aa-ADGF-B在雌蚊唾液腺（10．07）显著高表达。经分析，2条属于ADA2／ADGF亚家族，1条属于ADAL亚家族。

不同水解方法对刺梨渣多酚含量及活性的影响

该研究以刺梨渣为原料,分别经酸水解、碱水解以及酶水解得到刺梨渣提取液,测定提取液中多酚含量组成及体外抗氧化能力,并比较酚类物质与抗氧化能力之间的相关性。结果表明,刺梨渣提取液中游离多酚、游离黄酮含量最高(分别为84.44 mg RE/g和136.67 mg RE/g);碱水解得到的结合酚、结合黄酮含量最高(2.04 mg RE/g和5.89 mg RE/g)。抗氧化分析结果表明,游离酚抗氧化能力最强,对DPPH·、ABTS^(+)·清除能力、还原铁离子和铜离子的能力分别达到854.87μmol TE/g、995.35μmol TE/g、336.24μmol TE/g、1212.08μmol TE/g。皮尔逊相关性分析结果表明,多酚含量与抗氧化活性呈较强的正相关(P<0.05)。综上可知,刺梨渣富含酚类物质,且碱水解处理刺梨渣能释放更多的结合酚,具有较强的抗氧化活性。

水中镁离子对脂肪酶活性的影响

为初步探讨日常饮用水中镁离子对脂肪酶活性的影响情况,本试验通过体外试验方式,分别研究来源于深层海洋水和人工配制水中的镁离子(Mg2+)对脂肪酶活性的影响。通过设置5个Mg2+浓度梯度,利用脂肪酶对甘油三脂的分解作用,测定出不同组中脂肪酶活性,并与空白对照进行比较,计算出相对酶活力。结果表明,在本试验条件下,无论是来自深层海水还是来自人工配制水当Mg2+浓度达到25 mg/L后均对脂肪酶活力有提高作用;均表现为在本试验设计Mg2+浓度范围内,浓度为200 mg/L时,脂肪酶相对活力最高;相同Mg2+浓度的深层海洋水与人工水对脂肪酶活力影响效果相似。

白纹伊蚊雌蚊唾液腺匀浆血小板聚集抑制与抗凝血活性的探讨

本文旨在探讨白纹伊蚊Aedes albopictus唾液腺匀浆粗蛋白(salivary gland extract,SGE)血小板聚集抑制和抗凝血活性,为后续单个唾液蛋白在蚊虫吸血中的功能研究奠定基础。采用比浊法检测低、中、高浓度SGE在不同血小板聚集激活剂作用下对人血小板聚集活性的影响,手工法检测不同浓度SGE对人全血部分凝血活酶时间,凝血酶原时间,凝血酶时间的影响。结果显示,低浓度SGE对Ⅰ型胶原诱导的血小板聚集有显著抑制作用,随着浓度升高具有明显的量效关系,最高抑制率可达90. 36%;高浓度SGE对凝血酶诱导的血小板聚集具有显著抑制作用。SGE对ADP诱导的血小板聚集无明显抑制作用。SGE对人血浆APTT、PT、TT均有延迟效应,1. 25 ng/m L SGE即对TT有显著延迟效应。研究结果表明,白纹伊蚊SGE不仅对胶原诱导的血小板聚集有明显的抑制作用,而且可作用于血液级联凝集全过程。

20%瑞香狼毒素亚慢性染毒对大鼠骨髓及肝微核率的影响

目的探讨20%瑞香狼毒素对大鼠骨髓和肝脏的遗传毒性效应。方法 SD大鼠50只随机分为5组,20%瑞香狼毒素高、中、低剂量染毒组、阴性对照组和阳性对照组,每组10只,雌雄各半。高、中、低剂量染毒组灌胃量分别为500 mg/(kg.bw)、125 mg/(kg·bw)和31.25 mg/(kg·bw),1次/天,6天/周,连续90 d;阴性对照组给予纯水灌胃对照;阳性对照组按40 mg/(kg·bw)对大鼠进行30 h 2次给药法腹腔注射环磷酰胺。所有动物末次给药后6 h处死。检测各组大鼠胸骨嗜多染红细胞微核率和肝细胞微核率。结果组间比较:20%瑞香狼毒素低、中、高剂量组染毒后骨髓红细胞微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);染毒后,低、中剂量组的肝细胞微核率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P> 0.05),高剂量组肝细胞微核率高于阴性对照组(P<0.05)。组内比较:20%瑞香狼毒素高剂量组及阳性对照组的肝细胞微核率高于骨髓红细胞微核率(P<0.05)。结论 20%瑞香狼毒素亚慢性染毒对大鼠骨髓和肝脏微核率的影响不明显,但高剂量染毒时,其对大鼠肝微核率的影响大于骨髓。

埃及伊蚊丝氨酸蛋白酶抑制剂23的基因克隆表达与多克隆抗体制备

埃及伊蚊serpin23(丝氨酸蛋白抑制剂23)在雌蚊唾液腺特异高表达,是蚊虫唾液组分的主要蛋白之一。本文设计特异性引物序列,采用RT-PCR技术扩增获得埃及伊蚊广东电白株serpin23成熟肽序列,构建重组表达质粒pET-28a(+)-serpin23并测序验证。经IPTG诱导表达、KCl染色、切胶纯化获取了目的蛋白;制备了小鼠特异性抗serpin23蛋白多克隆抗体。结果显示:获得serpin23成熟肽序列,全长1 197bp,编码399个氨基酸。等电点pI为6.13,具有serpin结构域和一个功能未知的FAINT结构域。pET-28a(+)-serpin23重组质粒可表达了大小约为47 kDa、以包涵体表达为主的融合蛋白。Western Blot结果证明serpin23重组蛋白可以与抗-His标签和抗-serpin23抗体发生免疫反应,约47 kDa处产生特异性条带。本研究成功获得了埃及伊蚊广东电白株serpin23重组表达蛋白和抗serpin23多克隆抗体,为后续功能研究奠定基础。

重视地方性砷中毒机制假说间相互作用，提升机制研究及其转化应用价值

地方性砷中毒是我国政府高度重视的地方病，但受砷致病机制不明、缺乏癌变早期诊断指标以及无特效治疗药物等限制，地方性砷中毒尚未得到彻底控制。近年来国内外学者从分子、细胞、组织与系统等多个水平与层次对砷毒作用机制进行了较深入的研究，取得了一系列成果，也形成了一些假说。但同时也存在机制研究各自为政，各假说间缺乏相互联系，机制研究与转化应用衔接不够致应用价值有限等问题。因此，加强地方性砷中毒机制假说间相互作用及其转化应用研究，对推进科学防控地方性砷中毒有重要意义。

亚砷酸钠对L-02肝细胞微小RNA-191与金属蛋白酶组织抑制因子3表达的影响

目的了解亚砷酸钠（NaAs02）对人正常肝细胞（L-02）微小RNA-191（miR-191）与金属蛋白酶组织抑制因子3（TIMP-3）表达的影响。方法用不同剂量NaAsO：[O（对照组）、5、25、50、75i．Lmol／L]染毒I广02肝细胞24h；用5和25μmol／LNaAs02染毒L-02肝细胞0（对照）、12、24、48h；采用抑制剂（miR-191inhibitor）对miR．191表达进行干预。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测miR．191和TIMP-3mRNA表达；蛋白免疫印迹（Westernblot）法检测TIMP．3蛋白表达。结果量．效研究：miR-191和TIMP．3mRNA、蛋白表达组间比较差异有统计学意义（F=85．674、20．952、123．393，P均〈0．05），其中5、25、50、75μmol／L组miR-191表达（1．702±0．124、2．077±0．234、2．145±0．105、2．003±0．077）高于对照组（0．990±0．035，P均〈0．05）；25、50、75μmol／L组TIMP．3mRNA表达（0．848±0．067、0．804±0．081、0．813±0．076）低于对照组（0．996±0．007，P均〈0．05）。5p,mol／L组TIMP．3mRNA表达与对照组相比差异无统计学意义（0．939±0．133比0．996±0．007，P〉O．05）：5、25、50、75μmol／L组TIMP-3蛋白表达（0．846±0．093、0．611±0．123、0．554±0．098、0．529±0．067）低于对照组（1．006±0．003，P均〈0．05）。时．效研究：miR．191和r11MP．3mRNA、蛋白表达组间比较差异有统计学意义（5μmol／L剂量下，F=86．355、16．404、22．898，P均〈0．05；25μmol／L剂量下，F=104．321、20．123、52．321，P均〈0．05），其中5、25μmol／L处理12、24、48h组miR．191表达（1．392±0．152、1．691±0．167、2．018±0．130和1．456±0．167、1．946±0．178、2．259±0．256）高于对照组（1-001±0．014、1．008±0．027，P均〈0．05）；5μmol／L处理48h和25μmol／L处理12、24、48h组TIMP．3ITIRNA表达（0．824±0．093和0．897±0．033、0．815±0．089、0．709±0．103）低于对照组（1．004±0．018、0．997±0．057，P均〈0．05），5μmol／L处理12、24h组11MP．3tuRNA表达与对照组相比差异无统计学意义（0．952±0．072、0．929±0．121比1．004±0．018，P均〉0．05）；5和25μmol／L处理12、24、48h组TIMP．3蛋白表达（0．857±0．068、0．832±0．106、0．691±0．112和0．785±0．097、0．620±0．066、0．453±0．075）低于对照组（1．006±0．045、1．004±0．078，P均〈0．05）。miR-191inhibitor处理：各处理组miR-191和TIMP-3蛋白表达组间比较差异有统计学意义（F：104．306、67．015，P均〈0．05），miR．191inhibitor可以显著抑制砷所引起的miR．19l高表达（0．314±0．094比2．051±0．371，P〈0．05）并上调r11IMP．3蛋白的表达（1．965±0．277比0．541±0．183，P〈0．05）。结论L．02肝细胞中miR-191可应答NaAs02暴露，呈高表达状态，进而在蛋白翻译水平上抑制其下游靶基因TIMP-3的表达。

肝生化指标在燃煤型砷中毒中诊断价值ROC曲线评价

目的应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)探讨肝生化指标在燃煤型砷中毒中的诊断价值。方法2014年1月以贵州省兴仁县燃煤型砷中毒病区为调查点,采用生物化学法检测调查对象肝生化指标。绘制ROC曲线并计算曲线下面积(AUC)。结果砷中毒组血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量和白球比(A/G)均低于对照组(P<0.01),碱性磷酸酶(ALP)活性和总胆汁酸(TBA)含量均高于对照组(P<0.05);中、重度砷中毒组血清谷氨酰胺转移酶(γ-GT)高于对照组(P<0.05);与对照比较,轻度组ALB、A/G、TBA、TP、ALP的AUC分别为0.79、0.71、0.64、0.63、0.60(P<0.05);敏感度A/G>ALP>ALB>TBA>TP;中度组ALB、TBA、A/G、TP、ALP、γ-GT的AUC值分别为0.86、0.81、0.76、0.67、0.61、0.59(P<0.05),TBA>ALB>A/G>ALP>TP>γ-GT。重度组ALB、TBA、A/G、TP、ALP、γ-GT的AUC值分别为0.89、0.87、0.79、0.72、0.67、0.63(P<0.01),TBA>A/G>ALB>TP>ALP>γ-GT。结论 ALB、TBA含量和A/G有助于砷中毒的早期诊断及分度诊断;TP、ALP、γ-GT可作为砷中毒辅助诊断和分度诊断的参考指标。

抗伏马菌素单链抗体与碱性磷酸酶的融合表达及活性鉴定

为原核表达抗伏马菌素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白并分析其活性,本研究根据抗伏马菌素单链抗体H2的基因序列设计引物,PCR扩增获得目的基因,经限制性核酸内切酶SfiⅠ和NotⅠ的酶切位点克隆到pDAP2/S载体中,转化大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株XL1-Blue并鉴定阳性转化子。IPTG诱导H2-AP融合蛋白基因的表达,利用Western blot检测其表达情况,AP显色反应和ELISA鉴定其活性。结果显示成功构建了pDAP2/S-H2原核表达载体,融合蛋白在大肠杆菌中实现可溶性表达,并保留单链抗体和碱性磷酸酶的活性。因此,H2-AP融合蛋白通过原核表达后可用于发展伏马菌素的快速免疫检测方法。