渗透压对未成熟树突状细胞生物力学特性和免疫学功能的影响

目的从力学生物学角度研究渗透压对未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,im DCs)生物力学特性和免疫功能的影响。方法不同渗透压处理im DCs后,CCK-8检测细胞存活率,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架结构的变化,细胞电泳仪检测细胞电泳迁移率的改变,荧光偏振法检测细胞的膜流动性,实时荧光定量PCR检测免疫相关分子的表达变化,流式细胞仪检测细胞的抗原吞噬能力。结果高、低渗均会改变im DCs的F-actin结构,甚至诱导细胞凋亡。低渗组电泳率显著高于等渗组,高渗组电泳率低于等渗组(P<0.05)。荧光偏振结果显示,高、低渗均会显著降低细胞的膜流动性(P<0.05);q PCR结果发现,高、低渗会显著上调im DCs免疫表型分子CCR7、CD40、CD205、CD11a、CD11c的表达和抗原吞噬能力(P<0.05)。结论高、低渗应激会影响im DCs生物力学特性和免疫表型分子表达,研究结果对深入理解DCs的免疫调节功能具有重要意义。

新型冠状病毒RBD蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为原核表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(简称新型冠状病毒,severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)并制备多克隆抗体,利用基因克隆技术将RBD基因连接到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)上,电转化至大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,利用优化后的表达条件大量表达重组蛋白,经亲和层析纯化后通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。利用GST-RBD融合蛋白作为免疫抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA和Western blot分析抗血清的效价和特异性。PCR鉴定和序列测定结果显示,成功构建了重组载体pGEX-RBD和pET-RBD,在大肠杆菌中实现了GST-RBD和RBD-His融合蛋白的可溶性高效表达。研究获得的多克隆抗体的滴度达到约1∶3000,并具有良好的结合特异性。原核表达的可溶性新型冠状病毒RBD重组蛋白具有良好的免疫原性,为后续制备基因工程抗体奠定了实验基础。

家蝇幼虫对两种秸秆的消化及利用研究

本文旨在探明家蝇Musca domestic幼虫对高粱秸秆和小麦秸秆营养成分利用和木质纤维素的降解情况,以及不同配比秸秆饲料对家蝇生物学指标的影响,为今后产业化利用家蝇来生物降解秸秆类有机废弃物奠定理论基础。本研究采用70%高粱秸秆粉、70%麦秸秆粉和纯麦麸作为饲料,每种饲料各设置对照组、发酵组和家蝇幼虫取食组3种处理,检测并分析3种饲料各处理组中一般营养成分和木质纤维素的含量及变化;同时采用7种配比饲料喂养家蝇,观察各组家蝇不同发育阶段的体长、体重、存活率和发育历期等。结果表明:(1)3种饲料的各处理组中,一般营养成分和木质纤维素的含量均呈现:对照组>发酵组>家蝇取食组的趋势,此外除高粱秸秆组粗蛋白外,其余各组成份均差异显著(P<0.05);(2)小麦秸秆的木质纤维素含量>高粱秸秆>麦麸,且各组间均差异显著(P<0.05);(3)在相同秸秆配比条件下,高粱秸秆饲喂的家蝇其各虫态体长、体重、总存活率和发育历期均要优于麦秸秆喂养,且总存活率和发育历期与麦麸喂养相比差异不显著(P>0.05);(4)纯高粱秸秆喂养下家蝇仍能保持正常的生长发育,而在90%小麦秸秆喂养下,家蝇则无法存活。综上所述,家蝇适合作为生物转化器用于秸秆、尤其是高粱秸秆的降解,且降解效果优于单纯的微生物发酵降解,研究结果为今后规模化利用家蝇降解秸秆类有机废弃物提供了理论依据和科学基础。

基于异亮氨酸衍生物配体的配位聚合物的合成及其荧光应用

在溶剂热条件下,利用L‑异亮氨酸衍生物配体(C_(13)H_(19)NO_(3))与Zn(NO_(3))_(2)·6H_(2)O合成了配位聚合物[Zn_(2)(C_(13)H_(17)NO_(3))_(2)]_(n)(1)。单晶X射线衍射结果显示化合物1结晶于单斜晶系P2_(1)空间群,配体与金属离子桥联形成二维层状结构,层与层间通过范德瓦耳斯力形成了三维超分子网络结构。在化合物1合成过程中加入罗丹明B(Rho‑B),可以得到复合材料2。荧光测试结果显示,在激发波长为370 nm时,化合物1主要是基于配体的发光,而复合物2除配体的发光外,在580 nm处出现了Rho‑B的发射峰。利用配体与Rho‑B发射峰相对强度的比值为检测信号,将复合物2应用于金属阳离子和挥发性有机物(VOCs)检测。实验结果显示该材料能在水溶液中选择性识别Cr^(3+)离子,并且在短时间内对苯甲醛蒸气作出响应。

白介素10对人mDCs细胞骨架及其结合蛋白的影响

目的探讨白介素10(IC-10)对人成熟树突状细胞(mDCs)F-ccUn结构及其结合蛋白表达情况的影响&方法从新鲜的人外周血分选出CD141单核细胞,诱导培养成mDCs,用10 ng/ml IC-10处理48 h,利用激光共聚焦显微镜观察mDCs细胞骨架结构的变化,并通过Western b/t实验和免疫荧光实验分析IC-10对mDCs细胞骨架结合蛋白Fas-cin-1 Cofilin和磷酸化Cofilin(p-Cofilin)的表达及其定位的影响。结果IL-IO处理mDCs后,其F-actin含量明显上升,细胞突起增加,Fascin-1和p-Cofilin的表达水平上调,而且3种细胞骨架结合蛋白的定位均发生改变。结论IL-10能够影响mDCs细胞骨及其合的定位,细胞骨架结构发生重组,为研究IL-IO对mDCs免疫学功能的影响奠定了基础.

家蝇丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin15的克隆表达及重组蛋白的体外活性分析

为探明家蝇重组Serpin15蛋白的体外活性和酶稳定性,本文对家蝇Serpin15基因进行了生物信息学分析和克隆表达,并对纯化后的家蝇重组Serpin15蛋白进行了酶特性的研究。结果显示:家蝇Serpin15基因ORF框全长为1353 bp,编码450个氨基酸,理论分子量为51076.63 Da,有信号肽和一个标志抑制活性的功能结构域RCL反应环;成功构建原核表达载体pET-28a(+)-Serpin15,经诱导表达和纯化获得家蝇重组Serpin15蛋白;重组蛋白酶特性研究发现,家蝇重组Serpin15蛋白对胰蛋白酶有极显著的抑制作用,此外,将重组Serpin15蛋白经20~60℃热处理15 min,或经pH 6~10过夜处理,或经50℃和pH 8处理后室温存放15~90 min,重组蛋白的胰蛋白酶抑制活性均仍大于70%。研究结果为家蝇Serpin15蛋白的免疫功能研究奠定了重要实验基础,也为有害昆虫杀虫剂的研发提供思路。

单链抗体融合蛋白FvCA4-218-AP原核表达条件优化及活性检测

为实现抗镰刀菌单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白Fv CA4-218-AP在大肠杆菌中可溶性高效表达,本研究在不同诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等条件下培养重组大肠杆菌XL1-Blue[pDAP2/S-(Fv CA4-218-AP)],收集诱导培养的菌液,经过超声波破碎处理后离心收集总蛋白,并通过碱性磷酸酶直接显色法、Western blot和酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析抗镰刀菌单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达量、可溶性和活性等表达情况。结果显示在重组大肠杆菌培养至OD600为0.5时加入0.5 mmol/L IPTG,在25℃诱导表达6~8 h可获得较高表达量和活性的可溶性融合蛋白。因此,通过优化原核表达的诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等条件,可以显著提高抗镰刀菌单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白Fv CA4-218-AP的表达水平,为发展快速免疫检测方法提供了实验基础。

树突状细胞分化过程中部分微丝结合蛋白表达差异

通过研究树突状细胞(dendritic cells,DCs)分化过程中部分微丝结合蛋白的表达差异,以期进一步深入理解DCs的生物学行为并为DCs疫苗的临床应用提供理论依据。从人外周血中分离出单核细胞(monocytes,MOs),经细胞因子诱导获得未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs)和成熟树突状细胞(mature dendritic cells,m DCs)。利用蛋白免疫印迹法检测MOs、imDCs和m DCs中部分微丝结合蛋白的表达水平,然后联合逐步回归分析和主成分分析在这些微丝结合蛋白中筛选出起关键作用的蛋白。DCs分化过程中,Arp2/3复合体、caldesmon、gelsolin、WASP、WAVE 1、fascin、filamin A、α-actinin和Cap Z的表达水平均发生了不同程度的上调,formin的表达水平发生下调,profilin和VASP的表达水平没有明显变化。联合逐步回归分析和主成分分析发现,在这些微丝结合蛋白中,Cap Z可能在DCs分化过程中起关键作用。DCs分化过程中部分微丝结合蛋白的表达发生了明显变化,可能与其形态和免疫学功能的变化密切相关,这对深入理解DCs的生物学行为来说具有重要意义。

不同射线剂量对鼻咽癌细胞蛋白表达谱的影响

探讨不同的射线剂量对鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞蛋白表达谱的影响,以期从放射免疫学的角度深入理解NPC的临床治疗模式。利用固相p H梯度双向凝胶电泳研究5-8F NPC经不同射线剂量照射不同时间后的蛋白质表达谱,MALDI-TOF/TOF鉴定差异表达蛋白并用RT-qPCR和Western blot进行验证。发现不同射线对NPC细胞的蛋白表达谱有影响,并鉴定出24个差异表达的蛋白质,涉及抗原处理、抗原提呈、蛋白酶体泛素化和内质网应激等过程,其中热休克蛋白70A1A,蛋白酶体α、β等的表达水平呈射线剂量依赖性,可能是NPC细胞的肿瘤相关抗原。

前列腺癌干细胞的分离及鉴定

前列腺癌DU145细胞在普通培养基中培养至对数生长期,无血清培养基重悬细胞培养至形成球状体,以细胞三维(3D)培养和二维(2D)培养方法分离前列腺癌类干细胞,观察细胞球的形成及其生长情况,通过CCK-8细胞增殖实验和细胞划痕修复实验检测所分离细胞的增殖能力,结果显示前列腺癌DU145细胞在普通培养基中呈长梭形贴壁生长,无血清培养基培养72 h形成大量细胞球聚集体,细胞3D培养分离的细胞球的透明度和形态比2D培养分离的细胞好,3D培养分离细胞的增殖能力和划痕修复能力明显强于2D培养分离细胞。因此,细胞3D培养技术联合无血清培养基有利于前列腺癌干细胞的分离。

结直肠癌血液外泌体ceRNA网络的构建及生物信息学分析

为构建结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者血液外泌体circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)网络,预测差异表达基因(differentially expressed genes,DEGenes)之间的潜在调控机制,我们从exoRBase数据库下载健康人(Homo sapiens)及CRC患者血液外泌体中信使RNA(messenger RNA,mRNA)、长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)的基因数据,并进行差异筛选,共发现120个差异mRNAs,52个差异lncRNAs和81个差异circRNAs。利用多个数据库预测与lncRNA、circRNA和mRNA结合的miRNA,进而成功构建lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络。基因本体(gene ontology,GO)分析表明,ceRNA网络中的DEGenes主要涉及细胞高尔基体的生物学调控及结构维持、细胞黏附连接及酶的催化活性。京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of gene and genomes,KEGG)分析共富集到14条信号通路,主要涉及志贺氏菌(Shigella)病和MAPK信号通路。因此,本研究成功构建了CRC患者血液外泌体ceRNA网络,为探究CRC的发病机制奠定了基础。