内质网应激凋亡通路中Caspase12激活介导的肝纤维化大鼠肝细胞凋亡

目的:观察内质网应激凋亡通路中关键信号分子Caspase12活性变化,探讨其在肝纤维化大鼠肝细胞凋亡中的可能作用.方法:将Wistar大鼠随机分为正常4 wk组、正常8 wk组、肝纤维化4 wk组和肝纤维化8 wk组.皮下注射40%CCl_4花生油溶液诱导肝纤维化形成,剂量0.3 mL/100 g体质量,2次/wk.肝组织中GRP78、GRP94及Caspase12基因水平的表达通过实时荧光定量PCR技术测定;GRP78、GRP94、Procaspase12及活性Caspase12蛋白的表达采用蛋白质免疫印迹法检测;肝细胞凋亡通过TUNEL法测定.结果:肝纤维化4 wk组大鼠肝组织中GRP78、GRP94及Caspase12 mRNA表达显著高于正常4 wk组大鼠;肝纤维化8 wk时,肝组织中GRP78、GRP94、Caspase12 mRNA的表达较正常8 wk组显著增加.通过Western blot对各指标蛋白水平的检测发现,肝纤维化4 wk时大鼠肝脏中GRP78、GRP94、Procaspase12及活性Caspase12蛋白的表达较正常4 wk组大鼠显著增加;肝纤维化8 wk时,肝脏中GRP78、GRP94、Procaspase12、活性Caspase12蛋白的表达仍保持在高水平,但与肝纤维化4 wk时比较无显著差异.细胞凋亡检测发现,与正常组大鼠比较,肝纤维化4 wk及8 wk组大鼠肝细胞凋亡均明显升高.结论:内质网应激凋亡通路中关键信号分子Caspase12活化可能介导了肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的发生.

葛根素预处理上调内皮型一氧化氮合酶的表达减轻人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤

目的:探讨葛根素(puerarin,PUE)预处理对缺氧/复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用。方法:HUVECs随机分为正常对照(control)组、H/R组、单纯PUE组和PUE+H/R组(1.0×10^(-3)mol/L PUE预处理24 h后进行H/R)。采用Western blot方法检测内皮型一氧化氮合酶(e NOS)蛋白的表达,化学比色法检测组成型一氧化氮合酶(c NOS)的活性,TUNEL法检测细胞凋亡。此外,在PUE预处理前使用ERK蛋白激酶抑制剂U0126(1.0×10^(-5)mol/L)或PI3K/Akt蛋白激酶抑制剂LY294002(5.0×10^(-5)mol/L)处理细胞1 h,再进行H/R。结果:与control组相比,H/R组的e NOS蛋白表达水平降低(P<0.05),PUE预处理上调e NOS蛋白的表达水平(P<0.05),该上调作用均可被U0126及LY294002抑制(P<0.05);与control组相比,H/R组的c NOS活力下降(P<0.05),PUE预处理组的c NOS活力增加(P<0.05);与control组相比,H/R组细胞凋亡指数显著增大(P<0.01),PUE预处理组的细胞凋亡指数减小(P<0.01)。结论:H/R可使HUVECs受损伤,e NOS蛋白表达及活性降低,细胞凋亡增加。PUE预处理可通过ERK1/2信号通路和PI3K/Akt信号通路上调HUVECs的e NOS蛋白表达,增强e NOS活性,减少细胞凋亡,发挥内皮细胞保护作用。

重症肺炎患儿血清免疫球蛋白检测的临床意义

目的:了解重症肺炎患儿免疫球蛋白(Ig)A、Ig G及Ig M变化与其临床特征的关系。方法:住院治疗的重症肺炎患儿100例为观察组,健康体检的正常健康儿童30例为对照组,采用免疫比浊发测定观察组入院时和对照组体检当日清晨血清Ig A、Ig G及Ig M水平,记录Ig A、Ig G及Ig M降低在重症肺炎患儿的构成类型,分析不同Ig降低类型与重症肺炎患儿体温控制时间、肺部啰音吸收时间及临床治愈时间的关系。结果:观察组患儿血清Ig A、Ig G水平较对照组儿童低(P<0.05);重症肺炎患儿血清Ig降低以Ig A+Ig G二联为主,其次为Ig A降低和Ig A+Ig G+Ig M三联降低,单一Ig G降低及Ig A+Ig M二联降低少见,单一Ig M降低及Ig G+Ig M二联降低未见;Ig A+Ig G+Ig M三联降低型的重症肺炎患儿体温控制时间较Ig A+Ig G二联降低及单一Ig A降低患儿长;Ig A+Ig G+Ig M三联和Ig A+Ig G二联降低型患儿的肺部啰音吸收时间及住院时间较单一Ig A降低的患儿延长(P<0.05)。结论:重症肺炎患儿存在Ig降低,当存在两种或以上Ig降低时,临床上治疗难度较大。

辛二酰苯胺异羟肟酸对人肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对人肝星状细胞系LX-2增殖及凋亡的影响及其可能机制。方法体外应用SAHA作用于LX-2细胞,倒置显微镜观察LX-2细胞形态,MTT法检测细胞增殖;荧光显微镜及流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率;Western blot检测α-SMA、Ⅰ型胶原、ac H3K9、ac H3K14和ac H3K18蛋白表达。结果 SAHA呈剂量依赖性显著抑制LX-2细胞增殖(P<0.05);SAHA对LX-2细胞凋亡具有呈时间依赖性的促进作用(P<0.05);SAHA处理LX-2细胞后,α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显降低(P<0.05),而ac H3K9、ac H3K14和ac H3K18乙酰化修饰水平明显升高(P<0.01)。结论 SAHA抗肝纤维化的机制可能与下调α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达,上调组蛋白ac H3K9、ac H3K14和ac H3K18乙酰化修饰水平有关。

腺苷2a受体抑制剂抑制人非小细胞肺癌细胞系A549增殖和迁移

目的探讨腺苷2a受体抑制剂(A2aRi)对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖、迁移和凋亡的影响及其机制。方法将细胞分为对照组及干预组,干预组予不同浓度的A2aRi处理;用MTT法检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移; 24 h后,免疫荧光观察A2aR和caspase3在细胞中表达定位;用Western blot和RT-qPCR检测A2aR、caspase3蛋白和A2aR m RNA的表达。结果 A2aRi能抑制A549细胞的增殖(P<0. 01),其迁移能力减弱,A2aR红色荧光强度较对照组减弱,caspase3绿色荧光强度较对照组增强,两者均在胞质中表达。Caspase3蛋白表达增加(P<0. 01),A2aR蛋白表达减少(P<0. 01); A2aR m RNA表达下调(P<0. 05)。结论 A2aR在人非小细胞肺癌细胞系A549中高表达,A2aRi能抑制A549细胞增殖和减弱其迁移能力。

AngⅡ/AT_1R通路下调内皮型一氧化氮合酶磷酸化的机制研究

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor,AT_1R)通路通过激活蛋白磷酸酶2 A(protein phosphatase 2 A,PP2 A)导致大鼠肠系膜动脉中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)磷酸化水平下调的机制。方法:采用体重160~180 g成年雄性SD大鼠90只,在无菌条件下分离大鼠肠系膜动脉。首先明确AngⅡ下调大鼠肠系膜动脉中e NOS(Ser1177)磷酸化的效应,将肠系膜动脉随机分为正常对照(control)组和AngⅡ组,AngⅡ组用浓度为1×10^(-7)mol/L、1×10^(-6)mol/L和1×10^(-5)mol/L AngⅡ分别孵育离体大鼠肠系膜动脉血管6 h、12 h和24 h;然后进一步探讨AngⅡ使eNOS(Ser1177)发生磷酸化下调的分子机制,将肠系膜动脉随机分为正常对照(control)组、AngⅡ组和坎地沙坦(candesartan,CAN;AT_1R特异性抑制剂)+AngⅡ组(用1×10^(-5)mol/L CAN预处理大鼠肠系膜动脉血管1 h后,再用1×10^(-7)mol/L AngⅡ继续孵育12 h)。采用Western blot法检测肠系膜动脉中eNOS蛋白表达和eNOS(Ser1177)磷酸化水平,以及PP2Ac的蛋白表达、PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I^2^(PP2A)的表达水平,并用PP2A活性检测试剂盒测定大鼠肠系膜动脉PP2A活性变化。结果:(1)与control组比较,AngⅡ孵育离体大鼠肠系膜动脉血管6 h、12 h和24 h后,eNOS(Ser1177)磷酸化水平均明显降低(P<0.05),且12 h组和24 h组eNOS(Ser1177)磷酸化水平下降均出现明显浓度依赖性,但不同浓度组间eNOS蛋白表达水平差异均无统计学显著性;(2)与control组比较,1×10^(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,eNOS(Ser1177)磷酸化水平降低(P<0.05);CAN预处理可明显上调eNOS(Ser1177)磷酸化水平(P<0.05),且各组间eNOS蛋白表达水平差异无统计学显著性;(3)与control组比较,1×10^(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和I_2^(PP2A)蛋白表达均降低(P<0.05);CAN预处理可使PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和IPP2A2蛋白表达均增加(P<0.05),但各组间PP2Ac蛋白表达的差异无统计学显著性;(4)与control组比较,1×10^(-7)mol/L AngⅡ孵育肠系膜动脉血管12 h后,PP2A活性增高(P<0.05);CAN预处理可明显抑制AngⅡ对PP2A的激活作用(P<0.05)。结论:AngⅡ可通过AT1R通路激活PP2A,从而介导大鼠肠系膜动脉eNOS(Ser1177)磷酸化水平下调,其分子机制可能与PP2Ac(Tyr307)磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I_2^(PP2A)表达降低有关。

AngⅡ/AT_1R通路通过激活人脐静脉内皮细胞PP2A导致eNOS Ser1177磷酸化水平下调

目的:初步探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)/血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensinⅡtype1 receptor,AT_1R)通路是否通过激活人脐静脉内皮细胞蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)导致内皮型一氧化氮合酶(eNOS)Ser1177磷酸化水平下调。方法:将人脐静脉内皮细胞随机分为正常对照(control)组、AngⅡ处理组、单纯坎地沙坦(candesartan,CAN;AT_1R特异性阻断剂)组和CAN预处理+AngⅡ组。用Western blot方法检测各组eNOS总蛋白表达、eNOS Ser1177磷酸化水平、PP2Ac蛋白表达、PP2Ac-Tyr307磷酸化水平和PP2A内源性抑制蛋白I_2^(PP2A)表达水平。采用化学比色法检测各组细胞培养基中的NO含量。结果:与control组相比,AngⅡ处理后eNOS Ser1177磷酸化水平及细胞培养基中的NO含量降低(P<0.05);与同一浓度AngⅡ组相比,CAN预处理可增加eNOS Ser1177磷酸化水平及细胞培养基中的NO含量(P<0.05);各组间eNOS蛋白表达差异无统计学显著性。与control组比较,AngⅡ处理后PP2Ac Tyr307磷酸化水平和I_2^(PP2A)表达降低(P<0.05);与同一浓度AngⅡ组相比,CAN预处理可增加PP2Ac Tyr307磷酸化水平和I_2^(PP2A)表达(P<0.05);各组间PP2Ac蛋白表达差异无统计学显著性。结论:AngⅡ可通过AT_1R通路导致人脐静脉内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化水平下调,NO合成减少,这一效应可能与AngⅡ/AT_1R通路降低PP2Ac Tyr307磷酸化水平和I_2^(PP2A)表达水平、导致PP2A活性增强有关。特异性AT_1R阻断剂CAN预处理可通过增加PP2Ac Tyr307磷酸化水平和I_2^(PP2A)表达水平而降低PP2A活性,最终上调eNOS Ser1177磷酸化水平,恢复eNOS活性。

阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织Wnt4/β-catenin信号通路的干预作用

目的探讨阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织Wnt4/β-catenin信号通路的干预作用。方法 36只SD大鼠,随机分为假手术组、模型组和阿托伐他汀组,各组分别设7 d、14 d两个时间点。HE、Masson、PAS染色法观察肾脏病理改变;免疫组化观察Wnt4和β-catenin蛋白在肾组织的表达;Western印迹检测各组大鼠肾皮质Wnt4、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β、Ecadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白的相对表达量。结果与假手术组相比,模型组肾皮质Wnt4和β-catenin、p-GSK-3β、α-SMA蛋白表达显著增多(P<0.05),CollagenⅠ沉积增多(P<0.01),E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.01),GSK-3β在各组大鼠肾组织表达无差异;与模型组相比,阿托伐他汀组肾组织Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β和α-SMA蛋白表达减少(P<0.05),CollagenⅠ蛋白沉积显著减少(P<0.05),并伴有E-cadherin蛋白表达显著增多(P<0.05),而GSK-3β蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论 Wnt4/β-catenin信号通路的活化促进了UUO大鼠肾脏纤维化的发生发展,阿托伐他汀能改善肾脏纤维化病变,减轻肾间质细胞外基质的沉积,可能与其抑制Wnt4/β-catenin信号通路的激活和传导有关。

DNA甲基转移酶及分泌型卷曲相关蛋白1在糖尿病肾脏疾病大鼠肾组织中的表达研究

目的 探讨DKD大鼠肾组织中DNA甲基转移酶(Dnmts)及分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)的表达变化及意义。方法 16只雄性SD大鼠随机分为DKD组与正常对照(NC)组,每组8只。造模成功10周后处死,检测相关生化指标并计算肾脏指数(KI);HE、Masson染色观察肾组织病理学改变;Western blot检测Dnmts、Sfrp1、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、col-Ⅲ、col-Ⅳ蛋白表达变化;q-PCR检测Sfrp1mRNA表达水平;分析Sfrp1与Dnmts相关性。结果 与NC组比较,DKD组血糖[(8.51±1.19)vs(21.00±2.24)mmol/L]、24hUAlb[(12.22±4.91)vs(65.31±18.03)mg]、KI[(6.80±0.53)vs(12.15±1.57)mg/g]均增高(P<0.01);Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b、β-catenin、p-GSK3β蛋白表达水平上调(P<0.05);Dnmt3l未见明显变化;Sfrp1 mRNA和蛋白表达水平均下调(P<0.05);Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b与Sfrp1的蛋白表达呈负相关(r=-0.811、-0.692、-0.855、-0.858;P<0.01);与Dnmt3l无相关性(r=-0.262,P=0.411)。结论 DKD大鼠肾组织Dnmts蛋白表达增加,可能引起sfrp1表达下调,导致对Wnt信号通路的抑制作用减弱,Wnt信号通路异常活化并促进DKD时肾纤维化的发生发展。

吡格列酮调控β-连环蛋白表达延缓糖尿病大鼠肾脏纤维化的组织和细胞实验研究

目的在组织和细胞水平研究吡格列酮通过调控Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路延缓糖尿病大鼠肾脏纤维化的发生发展。方法18只SD大鼠随机分为正常对照(NC)组、DKD组和吡格列酮治疗组(PIO),每组各6只。HE、Masson染色观察肾组织形态学变化。大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为正常糖组(Con)、高糖组(HG)、吡格列酮处理组(HG+PIO)、HG+空载组(HG+E)和HG+PPARγ过表达组(HG+PPARγ)。免疫细胞荧光观察细胞中β-catenin表达;Western blot法检测大鼠肾组织和NRK-52E细胞相关蛋白表达变化。结果与NC组比较,DKD组PPARγ表达降低(P<0.05),磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)、β-catenin、细胞核β-catenin、Ⅳ型胶原(CollagenⅣ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)和Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)蛋白表达升高(P<0.05),与DKD组比较,PIO组PPARγ表达升高(P<0.05),p-GSK3β、β-catenin、细胞核β-catenin、CollagenⅣ、CollagenⅢ和CollagenⅠ表达降低(P<0.05)。与Con组比较,HG组PPARγ降低(P<0.05),p-GSK3β、β-catenin、细胞核β-catenin、CollagenⅣ、CollagenⅢ和CollagenⅠ蛋白表达升高(P<0.05),与HG组比较,HG+PIO组PPARγ表达升高,p-GSK3β、β-catenin、细胞核β-catenin、CollagenⅣ、CollagenⅢ和CollagenⅠ表达降低(P<0.05)。与HG组比较,HG+PPARγ组PPARγ表达升高(P<0.05),p-GSK3β、β-catenin、CollagenⅣ和CollagenⅢ表达降低(P<0.05)。结论吡格列酮可上调PPARγ表达,下调β-catenin表达,抑制Wnt/β-catenin通路活化,减少ECM沉积,延缓糖尿病肾脏纤维化的发生发展。