亚慢性砷染毒对大鼠精子形态的影响

目的：探讨亚慢性砷染毒对大鼠精子超微结构的影响。方法：清洁级SD雄性儿童期大鼠40只,体重100~120 g,随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组;染砷组自由饮用含三氧化二砷（As2O3）的蒸馏水,低、中、高剂量的砷浓度分别是25、50和100 mg/L,对照组自由饮蒸馏水,连续喂养3个月;实验结束后处死大鼠,采用扫描电镜（SEM）观察大鼠精子超微结构的改变。结果：对照组、低、中、高剂量组顶体完整率分别为（92.4±8.57）%、（85.7±7.7）%、（70.4±6.6）%、（50.0±6.11）%,头部畸形率分别为（8.5±3.6）%、（15±5.9）%、（34.0±9.8）%、（49.8±6.44）%,尾部畸形率分别为（10.2±5.8）%、（16.9±8.3）%、（32.7±7.0）%、（41.8±4.7）%,中、高剂量组与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论：亚慢性砷染毒能导致大鼠精子超微结构发生改变。

不育男性精子DCXR mRNA表达与顶体酶阳性反应率的关系

目的探讨原因不明男性不育患者精子DCXR mRNA的表达与顶体酶阳性反应率和受精力的关系。方法收集88例精液标本,其中正常生育组20例,不育男性68例。参照世界卫生组织(WHO)标准方法对标本进行精液常规分析,68例不育标本分为不育A组和不育B组。采用实时荧光定量PCR法,检测DCXR基因mRNA的相对表达量;以固定底物膜法观察顶体酶阳性反应率;以人精子穿透去透明带金黄地鼠卵异种体外受精试验(SPA)检测精子受精力。结果实时荧光定量PCR检测结果显示:正常生育组的精子DCXR基因mRNA的相对表达量明显高于不育A、B两组,经统计学分析均有显著性差异(P<0.05);不育A、B两组的精子顶体酶阳性反应率和受精率与正常生育组比较均有显著性下降(P<0.05)。相关性分析提示精子DCXR基因mRNA的相对表达量与顶体酶阳性反应率存在正相关性(r=0.440,P<0.01),精子DCXR基因mRNA的相对表达量与受精率存在正相关性(r=0.422,P<0.01)。结论原因不明男性不育患者精子DCXR mRNA的表达减少,精子DCXR mRNA的表达与顶体酶阳性反应率和受精率有一定相关性。

沉默附睾P34H基因对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶活性的影响

目的:通过慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)敲低P34H表达,分析其对小鼠精子P34H表达和精子透明质酸酶(HYD)活性的影响。方法:构建3种附睾精子P34H shRNA慢病毒表达载体GV-P34H-sh RNA-1、GVP34H-sh RNA-2和GV-P34H-sh RNA-3,提取阳性克隆质粒测序,转染HEK293T细胞,生产慢病毒颗粒。将3种重组慢病毒及阴性对照病毒分别注入小鼠附睾中,用real-time PCR和Western blot法分别检测其对P34H m RNA和蛋白的沉默效果。采用免疫荧光法观察P34H蛋白在小鼠精子上的定位,改良透明质酸钠-明胶底物膜法检测小鼠精子HYD活性(HYD阳性反应率和HYD活性强度)。结果:测序结果证实3种慢病毒载体均包装成功。感染小鼠附睾后,P34H的mRNA及蛋白表达量均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P<0.05);其中以GV-P34H-sh RNA-1作用最为显著,精子P34H阳性表达率和HYD活性均较阴性感染组和正常对照组明显降低(P<0.05),而阴性感染组和正常对照组相比差异无统计学显著性。结论:附睾P34H基因沉默可抑制小鼠附睾中精子P34H阳性表达率和HYD活性。

BEZ235通过靶向作用PI3K/AKT/FoxO1改善EAE的实验探究

探讨BEZ235通过靶向作用PI3K/AKT/FoxO1治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的相关机制。取60只C57BL/6小鼠,用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)和完全弗氏佐剂(CFA)诱导建立EAE模型。小鼠免疫后分别用PBS或BEZ235(5mg穔g-1/d-1)进行灌胃治疗,随机分为EAE组和治疗组。观察小鼠的临床评分,治疗后取脊髓行H&E和LFB染色,观察小鼠脊髓中炎性细胞浸润及脱髓鞘变化。Western blotting检测IL-17、PI3K/AKT/FoxO1在小鼠脊髓中表达;流式细胞术检测T细胞增殖、活化、凋亡、Tregs、初始T细胞、效应T细胞比例。

神经生长因子对体外培养角膜缘干细胞的作用

目的探讨神经生长因子(NGF)对体外培养角膜缘干细胞(LSCs)的影响及其受体在LSCs上的表达与细胞增殖的关系。方法体外培养LSCs,分对照组和NGF组传代培养,分别选取各组培养1 d、3 d和5 d的细胞,免疫细胞化学检测p63、TrkA、p75表达。结果 NGF组在1 d、3 d、5 d时间点p63表达平均灰度值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。NGF组各时间点TrkA表达平均灰度值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。NGF组各时间点p75表达平均灰度值低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析TrkA表达平均灰度值与p63表达平均灰度值,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NGF有维持LSCs的干细胞特性的作用,LSCs可表达NGF受体TrkA和p75,且TrkA的表达与LSCs的增殖有相关性。

大半夏汤对化疗呕吐家兔胃Cajal间质细胞水平影响研究

目的:分析大半夏汤对治疗呕吐家兔胃Cajal间质细胞水平的影响,为揭示大半夏汤止呕机理提供参考依据。方法:选取健康家兔,随机分为对照组、DDP组、大半夏汤高剂量组、大半夏汤中剂量组、大半夏汤低剂量组和胃复安组共6组,对DDP组、大半夏汤高中低剂量组和胃复安组家兔采用腹腔注射顺铂法,制备化疗呕吐家兔,制备成功后,按要求分别给药。连续给药7天后,记录6组家兔24小时内的呕吐物量、呕吐次数等情况;检测各组呕吐家兔胃排空率及血浆SP含量;采用ELISA法,分别检测6组家兔胃Cajal间质细胞(ICC)水平。结果:大半夏汤高中低剂量组、胃复安组家兔的呕吐物量和呕吐次数明显少于DDP组,差异有统计学意义(P<0.05);大半夏汤高中低剂量组、胃复安组胃排空率、SP含量、ICC含量均高于DDP组,差异有统计学意义(P<0.05);大半夏汤高剂量组呕吐物量、呕吐次数、胃排空率、SP含量及ICC含量与胃复安组相近,差异无统计学意义(P>0.05);大半夏汤高剂量组胃排空率、SP含量、ICC含量分别为(68.32±7.19)%、(16.34±2.32)ng/L、(0.26420±0.01621)IU/ml,大半夏汤中剂量组三指标分别为(54.68±6.37)%、(12.50±2.16)ng/L、(0.21325±0.010252)IU/ml,低剂量组三指标分别为(46.15±7.21)%、(9.23±2.08)ng/L、(0.18645±0.005469)IU/ml,三组之间各指标两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:大半夏汤对化疗所致呕吐有较好疗效,能提高化疗呕吐家兔胃ICC含量,大半夏汤的止呕机理可能与其能提升ICC水平有关。

大承气汤对Wistar大鼠小肠Cajal间质细胞起搏电流影响分析

目的:探讨大承气汤含药动物血浆对Wistar大鼠小肠Cajal间质细胞起搏电流影响,为大承气汤对胃肠道Cajal间质细胞的离子通道的研究提供参考依据。方法:选取8~14天SPF级的Wistar大鼠共20只,雌雄不限,培养大鼠小肠Cajal间质细胞,并采用免疫细胞化学法对其进行鉴定;取Wistar大鼠20只,体重350±20克,雌雄不限,制备服大承气汤含药动物血浆;采用膜片钳技术记录并分析大乘气汤含药动物血浆对Wistar大鼠小肠Cajal间质细胞起搏电流影响。结果:免疫细胞化学法鉴定小肠Cajal间质细胞培养成功。大乘气汤含药血浆条件下,Wistar大鼠小肠Cajal间质细胞起搏电流为~418±60PA,电流振幅相对对照组增加52.6%,差异有统计学意义(P<0.05);频率为15±0.82次/分钟,相对对照组增加76.4%,差异有统计系意义(P<0.05)。结论:大承气汤含药动物血浆对Wistar大鼠小肠Cajal间质细胞的起搏电流有明显的加强作用,大承气汤可通过加强胃肠道Cajal间质细胞起搏电流,改善MODS胃肠运动功能障碍。

hUMSCs向胰岛前体细胞诱导分化过程中Notch1和神经元素3的表达

目的:探讨人间充质干细胞(hUMSCs)向胰岛前体细胞诱导分化过程中Notch信号通路受体Notch1与神经元素3(Ngn3)变化。方法:分离培养并鉴定hUMSCs,采用分阶段联合诱导法(前10 d用含EGF低糖培养基诱导,后11 d用含激活素A和尼克酰胺高糖培养基诱导)诱导hUMSCs向胰岛前体细胞分化,设单独培养的hUMSCs作为对照;观察诱导分化前后细胞的形态变化,免疫细胞化学法检测诱导后细胞Ngn3、胰高血糖素(Glucagon)表达鉴定胰岛前体细胞,电镜下观察诱导后胰岛前体细胞改变;采用免疫细胞化学法、real-time PCR法及Western blot法检测诱导第7天、第14天及第21天时细胞中Notch1及Ngn3的表达;Western blot法检测诱导并加入γ分泌酶抑制剂(DAPT)后第21天时细胞中Notch1及Ngn3的表达水平。结果:诱导后Glucagon免疫组化染色呈阳性,出现胰岛前体细胞集落,电镜下可见胞体内有分泌颗粒;real-time PCR和Western blot结果显示,Notch1水平在诱导后第7天时最高,Ngn3水平至第14天时达到峰值;添加Notch信号通路抑制剂后Ngn3表达水平升高。结论:Notch信号通路可能通过激活Notch1受体与下游基因Ngn3共同调控体外诱导hUMSCs向胰岛前体细胞分化过程。

亚慢性砷中毒对大鼠睾丸间质细胞caspase-3表达及血清中睾酮含量的影响

目的探讨亚慢性砷中毒对大鼠睾丸间质细胞caspase-3表达及血清中睾酮含量的影响。方法将40只健康成年清洁级SD雄性大鼠按体质量（150～220g）采用随机数字表法分为4组，分别为对照组（饮用蒸馏水）和2．0、12．0、60．0mg／L三氧化二砷（As203）染毒组（低、中、高剂量组），每组10只，采用自由饮水方式进行染毒，连续染毒14周。采集各组大鼠心脏血，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中睾酮的浓度；采集各组大鼠睾丸组织，免疫组织化学法对睾丸间质细胞caspase-3表达进行定位和半定量检测，Biomias图像分析软件测定caspase-3阳性细胞平均灰度值。结果各组间大鼠血清中睾酮含量比较差异有统计学意义（F=37．99，P〈0．05）。其中，中、高剂量组大鼠血清中睾酮含量[（1．6946±0．2554）、（1．3505±0．2819）ng／L]均低于对照组[（3．0823±0．6530）ng／L，P均〈0．05]。对照组，低、中、高剂量组大鼠睾丸caspase-3阳性间质细胞计数分别为（8．10±1．91）、（9．80±2．15）、（10．00±1．83）、（10.90±2．38）个／视野，各组间比较差异有统计学意义（F=3．17，P〈0．05），中、高剂量组均高于对照组（P均〈0．05）。对照组，低、中、高剂量组caspase-3阳性细胞平均灰度值分别为135．10±6．89、130．00±3．30、117．10±4．28、113．10±5．38，各组间比较差异有统计学意义（F=41．09，P〈0．05），中、高剂量组均低于对照组（P均〈0．05）。结论As2O3对雄性生殖细胞毒性机制之一可能是通过上调SD大鼠睾丸间质细胞caspase-3的表达，启动细胞凋亡的信号传递途径，诱发睾丸间质细胞凋亡增加，睾酮含量下降，对生殖功能造成损伤。

腹腔感染对肠道Cajal细胞及肠道动力影响的研究

目的研究腹腔感染对肠道cajal细胞的影响,提高对腹腔感染的认识,为加强腹腔感染预防提供依据。方法随机选择实验使用的豚鼠20只,将其平均分为试验组和对照组,对照组豚鼠作为假手术组,实验组的作为腹腔感染组,针对两组豚鼠使用激光共聚焦显微镜对其肠道Cajal细胞的变化进行观察,并记录术后24h小肠传输功能和肠段平滑肌收缩情况。结果豚鼠的肠道推进率对照组为(80.24±3.54)%,高于实验组的(66.57±3.58)%,经比较,差异有统计学意义(P<0.05);两组豚鼠的肠道平滑肌收缩频率及收缩幅度比较,差异有统计学意义(P<0.05);对照组豚鼠的肌间神经丛c-Kit阳性细胞阳性面积、肠道全层铺片阳性细胞数的减少率,与实验组比较,差异有统计学意义(P<0.05);对照组的豚鼠其回肠在光镜下回肠黏膜完整,在肠壁上未发现有明显的充血和水肿现象,实验组的豚鼠其回肠黏膜在光镜下呈现不同程度的糜烂、坏死、肠壁水肿;对照组豚鼠Cajal细胞形成细胞间神经网络结构相对的完整,而实验组豚鼠的Cajal细胞形成的神经网络结构相对的稀疏,且c-Kit阳性细胞数目减少。结论腹腔感染对豚鼠的肠道Cajal细胞产生损害,进而造成肠道的动力学功能发生改变,所以需要重视在肠道疾病的治疗中的腹腔感染情况,加强对腹腔感染的控制与预防,可以提高肠道疾病的治愈率、生存率以及生存质量。

PAX6通过PI3K/AKT信号通路抑制mESCs增殖的研究

目的探讨PAX6对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)增殖的影响及其机制。方法用过表达PAX6慢病毒重组质粒载体感染mESCs,上调mESCs中PAX6的表达;采用CCK8检测PAX6对mESCs增殖的影响;采用流式细胞仪检测PAX6对mESCs周期的影响;采用葡萄糖生化试剂盒和ATP检测试剂盒分别检测mESCs葡萄糖和ATP含量;Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-P70S6K、P70S6K、GLUT1的表达。结果慢病毒重组质粒载体感染后,PAX6过表达组mESCs较对照组PAX6表达增加,细胞增殖受到抑制,并出现G1期阻滞(二倍体含量百分率55.54±1.00%vs 41.12±0.63%,P<0.05);与对照组比较,PAX6过表达减少mESCs中ATP(277.7±14.3 vs 804.4±13.4 umol/gprot,P<0.05)及葡萄糖含量(2.55±0.16 vs 5.16±0.15 mmol/L,P<0.05);与对照组相比,PAX6过表达组、PAX6过表达+BKM120组和BKM120组的p-PI3K,p-AKT,p-P70S6K,GLUT1蛋白表达量显著降低。结论 PAX6可通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性,减少mESCs中的ATP及葡萄糖含量,从而抑制mESCs的增殖。

血管内皮细胞生长因子及受体2在慢性砷中毒大鼠附睾中的表达

目的探讨慢性砷中毒对大鼠附睾中血管内皮细胞生长因子（VEGF）及受体2（VEGFR2）表达和细胞凋亡情况的影响。方法选择健康清洁雄性SD大鼠40只，体质量为160～200g，采用随机数字表法将大鼠随机分为高[60．0mg／L亚砷酸钠（NaAs02）]、中（12．0mg／LNaA．s02）、低（2．4mg／LNaAs02）剂量组和对照组（蒸馏水），每组10只，采用经口自由饮用方式连续染砷6个月。染砷结束后处死动物。迅速分离附睾。采用TUNEL细胞凋亡染色法检测大鼠附睾上皮细胞凋亡情况，免疫组织化学法检测附睾中VEGF及VEGFR2的表达水平。结果对照组，低、中、高剂量组大鼠附睾体部上皮细胞凋亡（124．68±6．59、138．96±8．48、152．59士10．79、170．69±16．60）比较，差异有统计学意义（F=10．562，P〈0．05），随着染砷剂量的升高，凋亡细胞增多。对照组，低、中、高剂量组附睾体部、头部、尾部VEGF水平（148．50±0．60、134．20±0．85、98．23±0．80，136．70±0．95、128．20±0．72、90．30±0．12，127．80±0．62、117．60±0．72、84．51±0．60，120．26±0．46、90．12±0．36、66．43±0．90）比较，差异均有统计学意义（F=46．445、45．867、41．381，P均〈0．05），各染砷剂量组VEGF水平均低于对照组俨均〈0．05）。对照组，低、中、高剂量组头部、尾部VEGFIL2水平（130．70±0．89、128．80±0．70。126．30±0．65、121．42±0．62，120．26±0．12、117．84±0．55，102．60±0．78、104．92±1．15）比较，差异均有统计学意义（F=3．452、2．701，P均〈0．05），各染砷剂量组VEGFR2水平均低于对照组（P均〈0．05）。结论慢性砷中毒对大鼠附睾中VEGF及VEGFR2表达有抑制作用，引起附睾上皮细胞凋亡。与男性不育有一定的关系。