彗星实验方法的优化及影响因素的分析

目的为了更有效地检测细胞DNA损伤,对彗星实验的影响因素进行优化并建立阳性对照。方法以传统碱性彗星实验为基础,对制胶方法、凝胶浓度、琼脂糖溶剂、裂解时间、细胞密度和电泳电压加以优化。以过氧化氢(H_(2)O_(2))作为DNA损伤诱导剂诱导HL-60细胞作为该实验的阳性对照。结果优化后的实验结果显示,制胶方法由三步法进步为两步法,以PBS为琼脂糖溶剂,0.8%正常熔点琼脂糖制备底层胶,0.7%低熔点琼脂糖与细胞悬液混合作为第二层胶,制胶效果好,操作更简单省时,较好地解决了脱胶问题。裂解1 h,1 V/cm电压电泳,获得了具有代表性的彗星图像,结果易于判读,能有效避免假阳性结果。并对不同浓度H_(2)O_(2)诱导的HL-60细胞DNA损伤情况进行比较,成功建立了彗星实验的阳性对照。结论与传统方法相比,优化后的彗星实验方法成本更低,更简单、快速、准确,重复性也更好,能够快速检测细胞中的DNA损伤。

重点实验室在创新型医学本科人才培养中的实践

结合贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心向本科生开放的模式,从高校重点实验室向本科生开放的基础、必要性,对培养学生实践能力和创新思维的意义,开放的方式以及取得的成效等方面探讨高校重点实验室向本科生开放在培养应用创新型医学人才中的作用。

丝素蛋白材料对成神经分化人脐带间充质干细胞生长的影响

目的 研究成神经分化的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)在丝素蛋白(SF)材料上的生长发育,明确细胞与SF膜材料的生物相容性。方法 从新生儿脐带分离培养hUC-MSC,接种在家蚕SF膜材料上,并诱导其向神经样细胞分化,作为实验组。同时在常规培养基上培养hUC-MSC作为对照组。对不同时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光染色,并通过CCK-8及流式细胞术等对细胞增殖及存活率等生物学性状进行分析。结果 经过诱导,hUC-MSC逐渐向成神经元样细胞分化,神经细胞特异性标志物Nestin和NSE呈阳性表达。SF薄膜能较好地支持成神经样分化hUC-MSC的生长。CCK-8及流式细胞检测表明SF膜能促进细胞的增殖并提高成活率。结论 SF膜具有良好的生物相容性,能有效支持成神经分化hUC-MSC的生长。

甲基结合蛋白1对小鼠胚胎干细胞增殖及克隆形态的影响

目的:研究甲基结合蛋白1(Mbd1)对小鼠胚胎干细胞克隆形态及增殖的影响。方法:设计针对Mbd1转录起始位点的gRNA,将表达有gRNA和Cas9蛋白的质粒使用脂质体转染方法转入小鼠胚胎干细胞(J1);使用抗生素将未转染成功的细胞杀死后,细胞继续培养7d,挑取单克隆细胞,采用PCR法筛选敲除Mbd1的纯合子细胞,观察Mbd1缺失对小鼠胚胎干细胞克隆形态的影响;使用细胞计数法检验Mbd1对胚胎干细胞增殖的影响。结果:通过Cripsr/Cas9成功获得敲除Mbd1的胚胎干细胞,Mbd1缺失后的小鼠胚胎干细胞丧失了常规小鼠胚胎干细胞的3D克隆形态,细胞呈现单层扁平克隆;Mbd1缺失后小鼠胚胎干细胞增殖速率变慢。结论:Mbd1通过影响小鼠胚胎干细胞克隆形态和增殖而影响胚胎干细胞的多能性。

红系祖细胞在造血缺陷斑马鱼体内的移植

目的评估红系祖细胞在先天原始造血缺陷cloche^(-/-)突变体斑马鱼体内的移植效果。方法收集绿色荧光标记红系祖细胞的转基因系zTg(gata1:EGFP)斑马鱼胚胎,制备成单细胞悬液,经流式细胞仪分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,利用显微注射技术将gata1^+细胞移植到42hpf的cloche^(-/-)突变体斑马鱼心脏中,采用体视荧光显微镜追踪观察移植后的红系祖细胞在cloche^(-/-)突变体斑马鱼中的表达情况。结果成功分选出携带绿色荧光的gata1^+细胞,并在移植后2 h可观察到携带绿色荧光的gata1^+细胞逐渐增殖扩散且16 h持续有绿色荧光表达。结论红系祖细胞有重建造血的潜力,为进一步研究红系祖细胞移植后的功能鉴定提供实验依据。

二氢杨梅素对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨二氢杨梅素(DMY)对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响。方法:将肺癌A549细胞分为DMY组和对照组,DMY组分成5组,分别加入终浓度1、5、10、15及20mg/L的DMY,对照组加入等量DMSO;各组细胞培养72h时,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,计算DMY对A549细胞的半数致死量(IC50值);选取IC50值附近浓度的DMY处理细胞,分别在24、48及72h时,采用MTT检测细胞存活率;肺癌A549细胞分为DMY组(终浓度大约为IC50值的DMY)及对照组,细胞培养48h时,采用Hoechst33342/PI双染法结合倒置荧光显微镜检测细胞凋亡,DNAladder凝胶电泳检测细胞内DNA的断裂程度。结果:DMY能显著抑制A549细胞的增殖,细胞抑制率随着DMY浓度的增加逐渐增高(P<0.01),呈明显的浓度依赖性,IC50值为(13.16±0.098)mg/L;以15mg/LDMY处理A549细胞,细胞存活率随着时间的延长逐渐降低(P<0.01),呈明显的时间依赖性;15mg/LDMY孵育A549细胞48h,Hoechst33342/PI染色后荧光显微镜下细胞核内呈现强蓝光,说明细胞处于凋亡状态,DNAladder凝胶实验检测发现凋亡DNA片段明显增加,出现Ladder现象。结论:DMY能抑制肺癌A549细胞增殖并促进其凋亡,可能与染色体DNA断裂有关。

Alexa Fluor 488 NHS Ester染料提高流式细胞周期检测结果的可行性

目的:探讨Alexa Fluor 488 NHS Ester染料用于提高流式细胞周期检测结果的可行性。方法:以293细胞作为研究对象,采用两种方案进行细胞周期检测,每种方案设4组;方案一,按照细胞周期检测试剂盒的说明书对4组细胞进行染色;方案二,先对4组细胞用0.0、0.4、2.0及10.0 mg/L的Alexa Fluor 488 NH S Ester染料染色15 min,然后将4组细胞混合在一支试管中再用碘化丙啶(PI)进行染色;将两种染色方案获得的细胞上流式细胞仪检测,分析比较两种方案的4组细胞检测结果。结果:方案一染色的4组细胞,流式细胞仪检测结果不尽一致,个别组间由于细胞密度不同导致染色结果存在差异;方案二经不同浓度Alexa Fluor 488 NHS Ester染色的4组细胞虽然混合于一支试管,检测结果经Flowjo X软件分析时能明显分出4群细胞,对4群细胞分别进行细胞周期分析比较,结果一致。结论:采用不同浓度Alexa Fluor 488 NHS Ester染料预染细胞后混合在一起进行PI染色能够提高细胞周期检测结果的可信度,在神经退行性疾病研究中可节约病人的取样次数及数量。

Tau蛋白通过外泌体传递到细胞外空间的研究

目的:验证HEK293-Tau细胞的外泌体中是否存在Tau蛋白、及Tau蛋白是否能够在细胞间通过外泌体传播。方法:通过经典的超速离心结合超滤法分离HEK293-Tau细胞的外泌体,通过透射电镜分析外泌体形态、采用Western blot鉴定外泌体特异性标记物(HSP70、CD63及CD9)及外泌体和细胞培养液中Tau蛋白表达。结果:超速离心结合超滤法成功地分离了HEK293-Tau细胞的外泌体,在透射电镜下观察到外泌体呈现典型的杯状形态,分离的外泌体中检测到HSP70、CD63及CD9等外泌体特异性标记物的表达;在外泌体及细胞培养液中能够检测到Tau蛋白的存在。结论: HEK293-Tau 细胞外泌体中存在Tau蛋白,并且Tau蛋白可以通过外泌体传递到细胞外空间。

二氢杨梅素对Bloom解旋酶结构和生物学活性的影响

目的二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY),是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗肿瘤等作用,研究DMY对Bloom解旋酶(Bloom helicase,BLM)生物学活性的影响对探索DMY的抗肿瘤机制具有重要意义。方法采用紫外光谱、圆二色谱、荧光偏振和自由磷检测等方法和技术研究DMY对BLM解旋酶的生物学活性的影响。结果圆二色谱和紫外光谱结果显示,DMY能与BLM解旋酶结合,且有1个结合位点;在0~25μmol·L^-1浓度范围内,DMY对BLM解旋酶的二级结构的干扰能力成正相关,在25~75μmol·L^-1浓度范围内则相反。荧光偏振和自由磷检测实验显示,DMY能结合在BLM解旋酶上,进而抑制BLM解旋酶的解链活性。结论DMY能够竞争性结合于BLM解旋酶的DNA结合位点上,改变BLM解旋酶的空间结构,从而抑制BLM解旋酶与DNA的结合,进而抑制BLM解旋酶的生物学活性。

汉防己甲素衍生物HL-49对Bloom DNA解旋酶生物学特性的影响

目的汉防己甲素衍生物是一类双苄基异喹啉类化合物,具有明显的抗肿瘤活性。研究汉防己甲素衍生物HL-49对Bloom DNA解旋酶(bloom DNA helicase,BLM)构象和生物学活性的影响对于探索其抗肿瘤作用机制具有重要意义。方法采用紫外光谱扫描研究药物HL-49对BLM DNA解旋酶构象的影响,荧光偏振技术和孔雀绿-磷钼酸铵比色法分析HL-49对BLM解旋酶的DNA结合活性、DNA解链活性、ATPase活性。结果紫外光谱扫描结果显示,HL-49对BLM DNA解旋酶的三维构象影响不明显。荧光偏振法结果显示,HL-49对BLM解旋酶的DNA(dsDNA/ssDNA)结合活性的影响不明显,但随浓度的增加,与DNA相互结合的能力越强(P<0.01)。随着HL-49浓度的增加,BLM DNA解旋酶的DNA解链能力下降,K_(obs)值逐渐降低。孔雀绿-磷钼酸铵比色结果说明,随着HL-49浓度的增加或作用时间延长,HL-49能明显抑制BLM DNA解旋酶的ATPase活性。结论汉防己甲素衍生物HL-49通过与DNA的可逆性结合,抑制BLM DNA解旋酶的ATPase活性和DNA解链活性。

hUC-MSCs对缺氧缺血脑损伤新生大鼠脑组织的保护作用研究

目的通过移植人脐带来源的间充质干细胞(hUC-MSCs)治疗缺氧缺血诱导的新生大鼠缺氧缺血性脑病(HIE),并探讨hUC-MSCs对神经细胞的保护作用及机制。方法采集足月健康新生儿脐带约10 cm,运用组织块贴壁法培养hUC-MSCs,通过感染重组携带绿色荧光蛋白的腺病毒标记细胞;取18只新生健康7d龄SD大鼠,随机均分为对照(假手术)、模型、治疗组,其中模型组及治疗组建立新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型,建模成功24 h后将标记的hUC-MSCs注射入治疗组左侧(损伤侧)侧脑室,各组大鼠hUC-MSCs移植治疗48 h后,检测hUC-MSCs在HIE大鼠大脑内的定植并采用TTC染色观察梗死脑组织,RT-qPCR测定海马组织中Beclin-2、Caspase-3 mRNA水平的变化,Western blot检测海马区细胞Beclin-2、Caspase-3蛋白的表达。结果对照组大鼠大脑没有形成梗死体积,模型组大鼠大脑梗死体积明显,梗死体积比为(41.67±4.17)%;治疗组大鼠经hUC-MSCs移植治疗48 h后,大脑梗死体积减小[(16.65±3.43)%],与模型组比较,差异有统计学意义;HIE建模48 h后,内源性Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白的表达上调。hUC-MSCs移植治疗48 h后,Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白的表达下降。结论hUC-MSCs能减小缺氧缺血损伤大鼠大脑梗死体积,对损伤大鼠有保护作用;hUC-MSCs能够减少大鼠脑细胞凋亡,下调缺氧缺血脑损伤大鼠海马区细胞凋亡相关Beclin-2、Caspase-3的mRNA以及蛋白水平。

miR-26b调控Wnt/β-catenin信号通路促进成肝样分化MSCs迁移研究

目的探讨miR-26b与Wnt/β-catenin信号通路、间充质干细胞(MSCs)不同分化状态的关系及其在MSCs向肝细胞生长因子(HGF)趋化迁移过程中的作用。方法以大鼠骨髓来源MSCs作为研究对象,用无血清诱导分化培养基分别培养0、7、14、21d,建立成肝样分化不同阶段的MSCs分化模型,qRT-PCR检测miR-26b在不同分化状态MSCs细胞中的表达;重组腺病毒(Ad-26b)感染MSCs实现miR-26b的高表达,并以空病毒感染MSCs为对照(Ad)后,检测细胞中信号分子active-β-catenin(ABC)、p-β-catenin、β-catenin的表达量以及Wnt/β-catenin经典靶基因c-Myc、RUNX2的转录水平,明确其对MSCs铺展面积和黏着斑的影响以及通过Transwell、Dunnchamber实验,比较其对不同分化状态MSCs趋化迁移的影响。结果随着诱导分化时间的延长,MSCs的miR-26b表达呈上升趋势,14d时,miR-26b的表达至高峰,与对照组比较有统计学意义(P<0.05);Ad-26b组较Ad组ABC蛋白水平升高,p-β-catenin的蛋白水平下降,而β-catenin总蛋白无变化,Wnt/β-catenin信号下游靶基因c-Myc,RUNX2的表达上调。Ad-26b组高表达miR-26b后可促使MSCs铺展面积变小并呈现极性分布,MSCs细小黏着斑数目增加并向细胞前端周边分布。Transwell及Dunncham-ber实验表明MSCs诱导分化至7d,向HGF的趋化迁移能力高于诱导分化0、14和21d。高表达miR-26b组较Ad组细胞向HGF的趋化迁移能力较对照组增强(P<0.05)。结论miR-26b通过调节Wnt/β-catenin信号通路影响MSCs的分化和趋化迁移。

斑马鱼白血病模型的研究进展

斑马鱼是一种脊椎动物有机体,因具有保守的造血过程和独特的实验优势,尤其适合用于研究人类白血病。目前,研究斑马鱼的最新技术包括转基因技术、基因组编辑技术和移植技术,通过这些技术现已构建了许多白血病模型。斑马鱼的通体透明与先进的谱系追踪和成像技术相结合,揭示了白血病发生、发展的许多细节。凭借这些优势,斑马鱼成为白血病研究中具有独特优势的模式生物之一,此外,基于斑马鱼的高通量药物筛选的进步有望加速新型白血病疗法的开发。

吉祥草水提物对小鼠慢性阻塞性肺疾病的作用和机制

目的:探讨吉祥草水提物对小鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)的作用及机制。方法:采用随机数字表法将昆明种小鼠其分为正常对照组(n=20)、模型组(n=30)和治疗组(n=20),模型组与治疗组小鼠通过过滤嘴香烟烟熏法建立COPD模型,治疗组在过滤嘴香烟烟熏8周后,予小鼠吉祥草水提物灌胃治疗15 d,模型组和正常对照组予以同剂量纯水灌胃;于灌胃15 d后,采用FlexiVent肺功能仪检测小鼠气道阻力(Rrs)、气道弹性阻力(Ers)、动态顺应性(Crs)、主气道阻力(P-3Rn),ELISA法检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、环氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)和基质金属蛋白酶-9(MMP9)等炎症相关因子的含量,肺组织HE染色观察小鼠肺组织病理学变化。结果:与正常对照组比较,模型组小鼠呼吸系统Rrs增加、Ers增加、Crs降低以及P-3Rn增加(P<0.05或P<0.01),且血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9升高(P<0.05),说明小鼠COPD模型造模成功;与模型组比较,治疗组小鼠Rrs降低、Ers降低、Crs升高以及P-3Rn降低,并且血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2以及MMP9表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);肺脏HE染色显示,与模型组比较,治疗组小鼠气道结构未见明显异常,炎性细胞浸润减少,肺泡结构更完整,大小趋于正常。结论:吉祥草水提物可有效治疗烟熏所致的小鼠COPD症状,其机制可能与抑制炎症因子的表达、修复COPD小鼠肺脏病理损害有关。

胎儿血红蛋白的表达调控

胎儿血红蛋白是胎儿体内主要的血红蛋白类型,是由两条α肽链和两条γ肽链组成的四聚体。出生后胎儿血红蛋白在人体中的表达急剧降低至1%,由两条α肽链和两条β肽链组成的成人血红蛋白取而代之成为主要的血红蛋白类型。β地中海贫血和镰刀型细胞贫血发病原因均基于β-珠蛋白基因发生突变,致使β-珠蛋白合成不足或异常,进而引起一系列临床症状。诸多实验结果及临床疗效表明,提高患者体内γ-珠蛋白的表达可部分替代异常β-珠蛋白从而有效缓解患者的临床症状。随着基因治疗的发展,如何安全高效的再激活胎儿血红蛋白的表达成为治疗β型地中海贫血和镰刀型细胞贫血患者的重要科学命题。本文重点回顾近年来γ-珠蛋白表达的调控机制,以期对寻找更加有效激活胎儿血红蛋白的方法提供参考。

心血管发育相关基因mpx在斑马鱼早期胚胎发育中的表达

目的:探讨斑马鱼体内髓样特异性过氧化物酶(mpx)在胚胎发育过程中的表达模式。方法:按Trizol法提取斑马鱼总RNA后逆转录成cDNA,再以cDNA为模板RT-PCR扩增mpx基因片段;用基因重组技术构建pCS2^+-mpx重组质粒后将质粒酶切线性化,T3聚合酶制备mpx反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测mpx基因的表达。结果:成功构建了pCS2^+-mpx重组质粒,原位杂交结果显示在24 hpf,mpx基因在斑马鱼胚胎中间细胞团表达;从24 hpf开始,mpx基因在斑马鱼胚胎卵黄囊表面、心脏和轴向脉管系统中高表达,一直持续到72 hpf;尤其是在72 hpf,mpx基因在整个胚胎头部、卵黄囊表面、尾部中弥散表达。结论:mpx基因在斑马鱼心血管系统发育的时间和部位中都有表达,mpx基因可能参与调控斑马鱼心血管系统发育。

三种淀粉样前体蛋白胞外结构域突变体的建立及功能验证

目的:构建3种淀粉样前体蛋白(APP)胞外结构域突变体细胞株并进行功能的初步验证。方法:通过Touch down PCR的方法扩增E1结构域缺失的APP695片段以及E1和信号肽双缺失的片段,采用融合PCR的方法扩增E2结构域缺失的APP695片段,并将获得的片段连接于pCMV-APP695载体中得到APP胞外结构域突变体质粒;质粒转染CHO细胞后,添加G418筛选表达APP胞外结构域突变体的单克隆细胞系;通过Western blot方法检测APP胞外结构域突变体的表达及胞外分泌水平,分析信号肽对该突变体分泌的影响。结果:成功获得了APP的E1结构域突变体、E1/信号肽双缺失突变体以及E2结构域突变体细胞株,且APP突变体可以正常表达和分泌,但是信号肽缺失后APP突变体可以表达、而不能分泌。结论:APP的E1和E2结构域对APP蛋白的胞外分泌无影响。

hUC-MSC在成神经分化过程中的趋化迁移研究

目的探究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSC)向神经样细胞的分化,并对其分化的神经样细胞的趋化作用进行研究。方法检测hUC-MSC细胞表面的标记;无血清的诱导培养基[含2%二甲基亚砜(DMSO)和200μmol/L丁羟基茴香醚(BHA)]诱导其向神经细胞分化,并进行神经细胞特异性标志物神经上皮干细胞蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的免疫荧光染色检测,并对分化的成神经诱导过程中的形态变化进行鉴定。此外,不同分化状态的hUC-MSC,在加入500μL含有20 ng/mL浓度的基质细胞衍生因子(stromal Cell-derived Factor-1α,SDF-1α)的不含血清的L-DMEM培养基,利用倒置相差显微镜下拍照,统计迁移至室膜下方的细胞数。结果成功分离出hUC-MSC,行流式细胞仪检测结果显示MSC:CD71+、CD29+,而CD34-、CD45-符合MSC的生物学特征。对不同诱导时间的hUC-MSC免疫荧光结果的统计学分析,nestin的表达呈现出先增高后降低的趋势,NSE在诱导期和维持前期均为阴性,在整个过程中末期才开始表达,到维持48 h时有62.5%的细胞表达,维持72 h时有76.5%的细胞表达。不同成神经分化状态的hUC-MSC迁移能力不同,诱导30 h,细胞向SDF-1α的趋化迁移能力达到最强。结论hUC-MSC具有易分离并扩增培养的生物特性,能诱导分化成为成神经细胞,并且具有一定的迁移能力,该研究能为中枢神经系统细胞的移植提供理论基础。