家蝇三龄幼虫Mdctl基因原核表达及生物信息学分析

目的:构建家蝇C型凝集素基因(Mdctl)原核表达体系,对Mdctl基因及编码蛋白进行生物信息学分析。方法:采用生物信息学方法,分析Mdctl基因及编码蛋白;将构建的pET28a(+)/Mdctl重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21-DE3中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白并通过SDS-PAGE对表达产物进行分析;Ni-IDA法纯化重组蛋白,Western-Blot对其鉴定。结果:生物信息学分析显示,Mdctl基因开放阅读框全长333 bp,共编码110个氨基酸,理论分子量为13.13 kDa,等电点为4.49,信号肽位于1~22位氨基酸之间;Mdctl蛋白中存在Clect结构域,属于C型凝集素超家族;Mdctl重组蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中主要以包涵体形式表达,重组蛋白的相对分子质量与Mdctl蛋白两端融合6×His标签后的总分子量相一致。结论:成功构建Mdctl原核表达系统,并获得重组蛋白。

家蝇三龄幼虫Clip-Msp基因克隆及白假丝酵母菌刺激下的时空表达

目的:克隆家蝇的Clip-丝氨酸蛋白酶基因(Clip-Msp),并对Clip-Msp在白假丝酵母菌感染后的时空表达模式进行研究。方法:通过基因工程的方法,构建pMD19-T/Clip-Msp克隆载体;采用生物信息学方法,分析Clip-Msp基因的开放阅读框和氨基酸序列及Clip-Msp蛋白的功能结构域;以GAPDH作为内参照,于家蝇三龄幼虫感染白假丝酵母菌后3、12、24及48 h时,采用实时荧光定量PCR方法检测Clip-Msp在不同组织(体壁、脂肪体、血淋巴、唾液腺、肠道、马氏管和气管)中的表达情况。结果:成功构建pMD19-T/Clip-Msp克隆载体,生物信息学分析显示,Clip-Msp基因开放阅读框全长1524 bp,共编码507个氨基酸、无信号肽、存在跨膜区,属于非经典分泌型蛋白;Clip-Msp蛋白的N端存在一个Clip结构域,C端有一个Tryp_SPc催化结构域,属于单催化结构域Clip-丝氨酸蛋白酶超家族;白假丝酵母菌感染家蝇三龄幼虫后,Clip-Msp基因在不同时间点、不同组织中表达存在差异(P<0.05),3 h时以血淋巴中表达量增加最高,12 h时以脂肪体、气管、唾液腺及肠道中表达量增加为主、脂肪体内的相对表达量最高,24 h时肠道组织表达增加最明显、脂肪体次之,48 h时血淋巴中表达量高于马氏管及肠道。结论:成功克隆Clip-Msp基因,Clip-Msp基因主要分布在血淋巴、脂肪体和肠道组织。