骨髓间充质干细胞异体移植对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)异体移植对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用。方法全骨髓贴壁培养法获得大鼠BMSCs,流式细胞术检测细胞免疫表型,并诱导成骨方向分化。取雌性C57BL/6小鼠,随机分为3组:正常对照组、PBS组和大鼠BMSCs组,用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35~55联合完全弗氏佐剂诱导建立EAE模型。小鼠免疫后38d和48d腹腔注射PBS或大鼠BMSCs进行治疗,神经功能评分观察各组小鼠神经功能变化。二次治疗12d后取各组小鼠脊髓、脾脏和外周血。HE染色及Luxol fast blue染色观察脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失情况;脾脏制成单细胞悬液,细胞CFSE标记后10mg/L刀豆球蛋白(Con A)和MOG_(35~55)刺激培养3d,观察脾细胞增殖情况。ELISA检测大鼠BMSCs移植后外周血细胞因子干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素17(IL-17)含量。结果流式细胞术显示,大鼠BMSCs第3代(P3)细胞表达抗原CD29、CD90、CD106,不表达CD45。体外诱导其能向成骨分化。小鼠发病后,大鼠BMSCs组小鼠神经功能缺损症状较PBS组减轻,评分降低。HE染色和Luxol fast blue染色结果显示,大鼠BMSCs组脊髓炎细胞浸润和脱髓鞘比同时间点PBS组减轻(P<0.05)。Con A和MOG_(35~55)刺激培养后,PBS组和大鼠BMSCs组脾细胞增殖增加,而大鼠BMSCs组又较PBS组降低。与PBS组相比,大鼠BMSCs组血浆细胞因子IFN-γ、IL-17含量降低(P<0.05)。结论全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化BMSCs,大鼠BMSCs异体移植对小鼠EAE模型有治疗作用。

配对盒基因6/小鼠胚胎干细胞细胞系的建立及干细胞生物学特性分析

目的建立配对盒基因6(Pax6)/小鼠胚胎干细胞(m ESCs)细胞系并鉴定其干细胞生物学特性。方法体外培养m ESCs,将重组载体p EF1α-Pax6-IRES-AcGFP和空载体p EF1α-IRES-AcGFP分别用脂质体法转染m ESCs,经G418梯度及荧光蛋白双筛选后,使用细胞免疫荧光染色、免疫印迹法及RT-PCR技术检测Pax6的表达情况,流式细胞术检测Pax6/m ESCs阳性细胞的比例。将获得正确的细胞系分别采用细胞免疫荧光染色对其干细胞标志物阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)、八聚体结合转录因子4(OCT4)进行检测,碱性磷酸酶(AP)染色法对其多能性进行检测,流式细胞术检测增殖指数Ki67。将Pax6/m ESCs进行肾背囊下移植,移植物行HE染色观察其分化能力。结果 Pax6成功在m ESCs内表达,经G418筛选后,获得Pax6/m ESCs细胞系,流式结果显示,Pax6阳性率为90%,免疫荧光显示,干细胞标志物SSEA1、OCT4表达阳性且AP染色阳性,并且在体内移植后能向3个胚层分化。结论 Pax6成功在m ESCs内表达,经G418筛选后,获得细胞系Pax6/m ESCs并维持良好的干细胞特性。

β-神经生长因子基因克隆和诱导表达及其对PC12细胞的诱导分化作用

目的构建β-神经生长因子(β-NGF)慢病毒表达载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,应用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,探讨β-NGF在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况,及其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞分化的影响。方法从SD大鼠脑组织提取总RNA,反转录成c DNA,利用分子生物学技术,克隆鼠β-NGF基因完整编码区,将β-NGF基因定向插入载体p LVX-TRE3G-IRES中。将重组载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和载体p LVX-Tet3G分别转染空白HEK293FT细胞,制备收获慢病毒,共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导NGF表达(分为未转染组、0、100、500和1000μg/L Dox诱导表达组)。48h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。同时收集培养上清,1.ELISA检测各组上清内β-NGF的分泌量;2.制作条件培养基,加入PC12细胞培养基中进行诱导培养,观察PC12细胞诱导分化情况。结果双酶切和测序鉴定重组质粒p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正确;β-NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强;β-NGF在培养基的上清内表达,表达量随Dox剂量增加而增多。诱导表达的条件培养基可诱导PC12细胞形态改变,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白。结论成功重组慢病毒载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌,且该蛋白具有诱导PC12细胞向神经元样细胞分化的能力;运用Tet-On 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达获得不同剂量β-NGF蛋白。

β-神经生长因子的诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用

目的运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统探讨β-神经生长因子(β-NGF)在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况及其对角膜缘干细胞(LSCs)的作用。方法将p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT细胞进行扩增,收获慢病毒,再共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导β-NGF表达(分为未转染组、1000、100和1000μg/L Dox诱导表达组)。48 h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。体外分离培养LSCs,慢病毒共转染LSCs,分为对照组(未转染组)和诱导表达组[实验组A(慢病毒载体Dox 1000μg/L)、实验组B(慢病毒载体Dox 100μg/L)、实验组C(慢病毒空载体Dox 1000μg/L)],诱导表达48 h后细胞免疫荧光染色检测NGF及相关蛋白(p63、p38、Trk A)的表达情况。结果NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组及实验组C相比,实验组A的p63表达降低,Trk A表达降低,p38表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组及实验组C相比,实验组B的p63表达增加,Trk A表达增加,p38表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达不同剂量β-NGF蛋白,低剂量Dox诱导下NGF产生的微环境可促进LSCs的体外扩增,并能维持LSCs的干细胞特性。

内皮型一氧化氮合酶过表达对慢性低氧诱导小鼠肺动脉高压的作用

目的探讨内皮型一氧化氮合酶(eNos)基因体内转染对小鼠慢性低氧性肺动脉高压(PAH)的作用。方法将36只雄性清洁级昆明小鼠随机分为对照组、模型组和eNos治疗组,每组12只。采用间断性常压缺氧法建立小鼠慢性低氧性PAH的模型。观察4周后,将PEI/重组质粒复合物经尾静脉注射到eNos治疗组小鼠体内,其他2组注射等量生理盐水,继续低氧处理。转基因治疗30 d后,观察小鼠的一般情况、平均肺动脉压、右心室肥大指数及肺小动脉形态变化;采用RT-PCR方法检测外源荧光蛋白DsRed表达情况;采用Real-time PCR法检测各组肺组织eNos mRNA的表达;采用硝酸还原酶法检测各组小鼠肺组织NO含量。结果与对照组小鼠相比,模型组小鼠的右心室肥大指数及平均肺动脉压较高,肺小动脉管壁厚度增加,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组小鼠相比,eNos治疗组小鼠的平均肺动脉压及右心室肥大指数增高减轻,肺小动脉管壁增厚减轻,差异有统计学意义(P<0.05);eNos治疗组小鼠肺组织中可见外源性基因DsRed表达,eNos mRNA表达量和NO含量增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论外源性eNos基因体内转染能够改善慢性低氧诱导小鼠PAH模型的肺血管重构,使右心室肥大指数增高减轻,肺小动脉血管增厚减轻。

体内转染血管内皮生长因子基因对慢性低氧诱导小鼠肺动脉高压的影响

目的探讨血管内皮生长因子(Vegf)体内转基因对慢性低氧诱导小鼠肺动脉高压(PAH)的治疗作用。方法将昆明雄性小鼠36只随机分为3组:低氧Vegf治疗组(P-V组),模型组(PAH组),对照组(C组),每组12只。采用间断性常压缺氧法复制小鼠PAH模型。观察4周后,P-V组经尾静脉注射聚乙烯亚胺(PEI)包被的pBudCE4.1-Vegf-EGFP载体,其他组注射等量生理盐水,继续低氧处理。转基因治疗后30 d,观察小鼠的一般情况、平均肺动脉压(mPAP)、动脉血气、右心肥大指数[右心室/(左心室+室间隔)]及肺小动脉形态学改变,RT-PCR方法检测增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达情况;Real-time PCR方法检测各实验组肺组织Vegf mRNA量; ELISA方法及硝酸还原酶法分别检测各实验组肺组织VEGF和NO含量。结果 PAH组小鼠出现代谢性酸中毒,平均肺动脉压升高,右心室肥厚,肺小动脉管壁厚度(WT)增加,与C组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与PAH组相比,P-V组小鼠平均肺动脉压升高、右心室肥厚及肺小动脉管壁增厚减轻,差异有统计学意义(P<0.05)。与PAH组小鼠相比,P-V组小鼠外源基因Vegf的mRNA及蛋白水表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Vegf转基因治疗能上调慢性低氧诱导小鼠的肺组织中Vegf mRNA和VEGF的表达,从而拮抗肺动脉压升高,减轻右心肥厚及肺动脉血管增厚。