大蝎子草地上部分化学成分研究

目的:研究大蝎子草地上部分的化学成分。方法:采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶层析及MCI柱层析及结晶、重结晶方法分离纯化大蝎子草地上部分化合物,并运用波谱及化学方法对所分得的化合物进行结构鉴定。结果:从大蝎子草地上部分分离纯化得到5个化合物,经波谱解析鉴定为尿嘧啶、儿茶酚、5-硝基愈创木酚、β-谷甾醇及草酸,除化合物β-谷甾醇外均为首次从大蝎子草地上部分分离得到。结论:大蝎子草地上部分成分有尿嘧啶、儿茶酚、5-硝基愈创木酚、β-谷甾醇及草酸。

慢病毒转导敲低Smad7表达对大鼠原代心肌成纤维细胞增殖、迁移、细胞表型分化和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的探讨Smad7敲低后对原代心肌成纤维细胞增殖、迁移、胶原分泌和细胞表型转化的影响。方法原代培养10只SD大鼠乳鼠的心肌成纤维细胞,免疫组织化学染色鉴定细胞。采用慢病毒转染方法敲低心肌成纤维细胞Smad7的表达,Western blotting验证Smad7蛋白敲低效率,实时无标记细胞仪检测心肌成纤维细胞的增殖情况,细胞划痕实验检测细胞的迁移情况,Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和细胞表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。结果成功培养心肌成纤维细胞,并进行细胞鉴定。慢病毒转染的心肌成纤维细胞感染复数(MOI)值为100,转染后88.33%的细胞表达绿色荧光蛋白,慢病毒敲低组Smad7的蛋白表达明显下调(P<0.05)。慢病毒敲低Smad7后细胞增殖明显下降(P<0.01),细胞迁移率明显减少(P<0.01)。与对照组相比,慢病毒敲低组细胞ColⅠ表达明显下降(P<0.01),α-SMA表达明显升高(P<0.01)。结论Smad7表达敲低后,心肌成纤维细胞的细胞功能发生明显改变,这些改变可能与Smad7下调导致心肌纤维化程度加重有关。

艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞VEGF表达的调控作用

目的:研究艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞(RMCs)增殖的抑制作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将培养的RMCs分为正常对照组、甘露醇对照组、模型组、罗格列酮阳性对照组及艳山姜挥发油高(1μg/L)、中(0.5μg/L)、低(0.25μg/L)浓度组。给药48 h后,MTT法检测艳山姜挥发油对高糖诱导RMCs增殖的影响,苏木素-伊红染色(HE)进行形态学观察,划痕修复实验及transwell实验分别分析RMCs迁移能力和侵袭能力。免疫印迹法(Western blot)分析血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果:高糖作用后,RMCs增殖率、迁移及侵袭能力显著升高(P<0.01);VEGF蛋白表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,给予艳山姜挥发油及罗格列酮预保护能显著抑制RMCs的异常增殖(P<0.05),RMCs形态和数量趋近正常对照组,RMCs迁移和侵袭能力显著降低,同时显著下调了VEGF蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:艳山姜挥发油对高糖诱导下RMCs的增殖及VEGF蛋白的表达具有调控作用。

丹酚酸B抗心肌纤维化的机制研究

目的:研究丹酚酸B(Sal B)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞增殖、Ⅲ型胶原分泌及基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响,探讨其抗心肌纤维化的作用机制。方法:将细胞分为空白对照组(培养液)、AngⅡ模型组和Sal B低、中、高浓度组(12.5、25、50μmol/L),用空白或含药培养液培养细胞1 h后,除空白对照组外的其余各组均加入1μmol/L的AngⅡ诱导细胞增殖,共同作用24 h。分别采用MTT法和苏木精-伊红染色法考察Sal B对细胞增殖的影响;采用Western blot法检测Sal B对细胞Ⅲ型胶原、MMP-9、Smad2/3、Smad7蛋白表达的影响。结果:与空白对照组比较,AngⅡ模型组细胞明显增殖,Ⅲ型胶原、MMP-9、Smad2/3蛋白表达明显增强,Smad7蛋白表达明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ模型组比较,Sal B各浓度组细胞的增殖均受到抑制,Ⅲ型胶原、MMP-9、Smad2/3蛋白表达均减弱,Smad7蛋白表达均增强,除Sal B低、中浓度组细胞Ⅲ型胶原与Sal B高浓度组细胞Smad2/3蛋白表达变化不显著外,其余各指标差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Sal B抗心肌纤维化的作用可能与抑制心肌成纤维细胞的增殖,下调Ⅲ型胶原、MMP-9、Smad2/3蛋白表达和上调Smad7蛋白表达有关。

半枝莲活性物质含量测定及RAPD遗传多样性分析

目的:探究不同产地半枝莲活性物质总黄酮与野黄芩苷的含量差异以及遗传多样性。方法:采用紫外分光光度法测定总黄酮含量;采用HPLC测定野黄芩苷含量;采用RAPD对不同产地半枝莲进行遗传多样性分析;分析半枝莲总黄酮和野黄芩苷含量与RAPD遗传多样性的相关性。结果:不同产地半枝莲总黄酮平均含量为3.95%;野黄芩苷平均含量为0.24%;RAPD分析中,19个不同产地半枝莲遗传多态率为97.92%;聚类分析结果显示,在相似性系数为0.54～0.57时,分为两大类群;不同产地半枝莲遗传多样性与总黄酮含量无明显相关性,与野黄芩苷含量呈负相关关系。结论:不同产地半枝莲总黄酮及野黄芩苷含量差异较大,遗传多样性丰富,野黄芩苷含量与RAPD遗传多样性存在一定的相关性。

艳山姜挥发油调控NF-κB信号抑制LPS诱导的视网膜 Müller细胞炎症反应

目的:探索艳山姜挥发油对LPS诱导的视网膜Müller细胞炎症反应的保护作用及其作用机制。方法:采用LPS诱导视网膜Müller细胞发生炎症反应,给予低、高浓度艳山姜挥发油进行干预,分组为空白对照组、模型组、艳山姜挥发油低浓度组(1μg/L)、艳山姜挥发油高浓度组(5μg/L)。Western Blot法、ELISA法检测Müller细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达和分泌。Western Blot法检测NF-κB信号分子TLR4、IκBα、p-IκBα、P65、p-P65蛋白表达,IF法观察P65入核情况。进一步采用NF-κB特异性抑制剂PDTC处理Müller细胞后,检测IκBα、p-IκBα、P65、p-P65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达。结果:艳山姜挥发油能抑制LPS诱导Müller细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的合成与释放,抑制IκBα、p-IκBα、P65、p-P65蛋白表达,改善炎症反应。采用NF-κB特异性抑制剂PDTC干预后可抑制上述蛋白表达,且艳山姜挥发油+PDTC组与PDTC组比较无明显差异。结论:艳山姜挥发油可抑制LPS诱导的大鼠视网膜Müller细胞炎症反应,其作用机制与NF-κB信号的激活相关。

香茅醇微乳凝胶的制备及体外抗菌试验

目的:优选香茅醇微乳凝胶的处方及制备方法并对其进行体外抗菌试验研究。方法:以微乳区域面积百分比为指标,使用伪三元相图法优化香茅醇微乳的处方;以微乳凝胶的外观、黏稠度、延展性、油腻性为指标,通过单因素试验及正交试验优化香茅醇微乳凝胶的处方工艺。采用试管二倍稀释法考察香茅醇微乳凝胶对金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),通过时间-杀菌效率试验考察香茅醇微乳凝胶及香茅醇微乳的杀菌效率。结果:香茅醇微乳凝胶的最佳处方是15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯-乙醇-香茅醇-卡波姆-980-甘油-水(0.518∶1.037∶0.667∶0.8∶5∶91.978)。香茅醇微乳为淡蓝色透明均一液体,平均粒径54.9 nm,Zeta电位^(-1)0.22 m V。香茅醇微乳凝胶对金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的MIC和MBC均为1.667 g·L^(-1);时间-杀菌效率试验结果表明香茅醇微乳凝胶及香茅醇微乳在2 h对受试菌种的杀菌率达100%。结论:优选的香茅醇微乳凝胶处方工艺稳定可行,该制剂对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有杀伤作用,且起效快。

基于NOS信号的艳山姜挥发油对ox-LDL诱导HAECs损伤的保护作用

目的:研究艳山姜挥发油(EOFAZ)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人主动脉内皮细胞(HAECs)损伤的保护作用。方法:体外传代培养HAECs,EOFAZ保护作用研究分为7组,分别为空白组(无血清ECM),模型组(200 mg·L^(-1)oxLDL),EOFAZ高质量浓度组(200 mg·L^(-1)ox-LDL+100μg·L^(-1)EOFAZ),EOFAZ低质量浓度组(200 mg·L^(-1)ox-LDL+10μg·L^(-1)EOFAZ),阿司匹林组(Asp,200 mg·L^(-1)ox-LDL+2.5×10^(-4)mol·L^(-1)Asp),卡维地洛组(Car,200 mg·L^(-1)ox-LDL+1×10-6mol·L^(-1)Car),阿托伐他汀钙组(Atorv,200 mg·L^(-1)ox-LDL+1×10-6mol·L^(-1)Atorv);一氧化氮合酶(NOS)信号研究分为5组,分别为空白组(无血清ECM),模型组(200 mg·L^(-1)ox-LDL),EOFAZ组(200 mg·L^(-1)ox-LDL+100μg·L^(-1)EOFAZ),NOS抑制剂组(200 mg·L^(-1)ox-LDL+100μmol·L^(-1)L-NAME或300μmol·L^(-1)L-NMMA),EOFAZ加NOS抑制剂组(200 mg·L^(-1)ox-LDL+100μg·L^(-1)EOFAZ+100μmol·L^(-1)L-NAME或300μmol·L^(-1)L-NMMA)。噻唑蓝(MTT)法分析细胞存活率,酶标仪法及Griess试剂法分别检测培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性和一氧化氮(NO)含量。化学法检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测iNOS及eNOS mRNA表达水平。结果:与模型组比较,EOFAZ明显提高ox-LDL诱导损伤的HAECs的细胞存活率,抑制LDH外漏及iNOS活力(P<0.05,P<0.01),促进NO及eNOS的产生(P<0.05,P<0.01)。Real-time PCR分析表明,EOFAZ以及相关抑制剂显著下调iNOS mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01),上调eNOS mRNA表达水平(P<0.05)。结论:EOFAZ对ox-LDL诱导损伤的HAECs具有保护作用,其作用机制与调控eNOS和iNOS的表达水平有关。

氧化苦参碱通过调控MAPK信息通路改善醛固酮诱导的心肌细胞损伤

目的:研究氧化苦参碱(OMT)对醛固酮(ALD)诱导心肌细胞损伤的改善作用及其作用机制。方法:采用胰酶消化法和差速贴壁法分离和纯化新生大鼠心肌细胞进行培养,采用1×10^(-5)mol·L^(-1)ALD建立心肌细胞损伤模型。实验分为空白组,模型组(1×10^(-5)mol·L^(-1)ALD),ALD+OMT高浓度(3.78×10-4mol·L^(-1))组,ALD+OMT低浓度(1.89×10-4mol·L^(-1))组,ALD+JNK抑制剂(JNK I,5×10^(-6)mol·L^(-1))组,ALD+阿司匹林(Asp,1×10^(-5)mol·L^(-1))组,即OMT,JNK抑制剂和阿司匹林组先以相应药物预处理2 h后加入终浓度为1×10^(-5)mol·L^(-1)的ALD共同孵育24 h。二甲基噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,Giemsa染色观察心肌细胞形态学变化情况。蛋白免疫印迹法(Western blot)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析OMT对ALD诱导JNK蛋白表达水平,JNK磷酸化(p-JNK)水平及mRNA表达的影响。结果:与空白组比较,ALD可显著降低心肌细胞存活率(P<0.01)并改变细胞形态,OMT可显著改善醛固酮诱导的心肌细胞存活率降低(P<0.01)并使细胞恢复至正常形态;Western blot结果显示ALD可诱导JNK蛋白磷酸化水平升高(P<0.01),而OMT可显著抑制ALD诱导的p-JNK表达增加(P<0.01);Real-time PCR结果显示,与空白组比较,ALD可诱导JNK mRNA表达增加(P<0.01),使用OMT进行预保护后,各组基因表达均没有显著改变。结论:OMT对ALD诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,其作用机制与抑制JNK蛋白磷酸化密切相关。