人肠道来源样品中肺炎克雷伯菌的分离及特征研究

目的:了解重症监护病房(ICU)肠道来源样品(粪便)中肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)携带情况及其特征。方法:采用哥伦比亚培养基分离粪便样品中的肺炎克雷伯菌,对其进行16S rDNA测序并构建发育进化树;使用稀释平板法,参照CLSI(2017)标准测定分离的肺炎克雷伯菌对肠道感染常用抗生素耐药性。结果:共收集粪便样本54份,从中分离到14株肺炎克雷伯菌(携带率为26%);14株肺炎克雷伯菌与欧、美菌株亲缘关系较远,与亚洲肺炎克雷伯菌(Klebsiella singaporensis strain LX3)亲缘关系较近,14株肺炎克雷伯菌聚为2个分支;抗生素耐药性检测结果表明,14株菌株对红霉素、克拉霉素、链霉素、四环素、氯霉素、阿莫西林、甲砜霉素、甲硝唑和克林霉素耐药率为100%,仅对诺氟沙星不耐药(耐药率为0%)。结论:贵州ICU病人粪便分离的14株肺炎克雷伯菌与亚洲株亲缘关系较近,且对肠道感染常用抗生素具有较强耐药性,仅对诺氟沙星不耐药。

人肠道来源大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因突变株的构建

目的:使用嗜热二型内含子基因失活系统(Thermotargetron)失活人肠道来源大肠杆菌(HSM174 DE3)β-半乳糖苷酶基因(LacZ),构建lacZ失活突变株。方法:使用分子克隆方法,构建lacZ基因失活质粒pHK-TT1A-lacZ426a、pHK-TT1A-lacZ1879a、pHK-TT1A-lacZ1880a及pHK-TT1A-lacZ1155s,将基因失活质粒转化大肠杆菌HSM174菌株(E.coli HSM174),转化子培养时提高温度至48℃,诱导TeI3c/4c二型内含子“归巢”活性,采用蓝白斑及PCR筛选lacZ基因失活突变株。结果:随机挑选20株克隆菌株的PCR结果显示,lacZ426a、lacZ1879a、lacZ1880a及lacZ1155s基因失活效率分别为60%、75%、60%及75%;白斑克隆基因失活效率为100%。结论:Thermotargetron系统可高效的实现E.coli HSM 174菌株lacZ基因失活,并可能具有在中温菌中广泛应用的潜力。

人肠道来源艰难梭菌感染Caco-2细胞对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

目的:研究人肠道来源艰难梭感染Caco-2细胞对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。方法:用艰难梭菌毒素A和毒素B感染Caco-2细胞24 h,以未感染艰难梭菌毒素A和毒素B的Caco-2细胞为对照组,蛋白质免疫印迹法检测真核细胞核因子(NF-κB)通路蛋白P-p65和p65的表达;Caco-2细胞用6孔板制作爬片,待细胞长满6孔板后,以感染复数(MOI)=100加入艰难梭菌,与Caco-2细胞共培养3、6、9、12及24 h,革兰染色后油镜观察,记录黏附细菌数与细胞数,计算共培养时间与细菌黏附数量之间的关系;艰难梭菌感染Caco-2细胞12 h,以Caco-2为对照组,蛋白质免疫印迹法检测NF-κB通路蛋白P-p65、p65、IKKα及IκBα的表达。结果:艰难梭菌与Caco-2细胞共培养12 h时黏附数最多,P-p65和IKKα蛋白表达增加(P<0.05),p65和IκBα蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:人源艰难梭菌感染Caco-2细胞可激活NF-κB信号通路。

艰难梭菌中粪肠球菌污染的去除方法

目的:建立从粪肠球菌-艰难梭菌混合培养物中分离艰难梭菌的方法。方法:取不同厂家脑心浸出液(BHI)培养基、不同抗生素和是否添加羊血(或血清)3种组分进行组合,加入粪肠球菌-艰难梭菌混合物进行培养;显微镜观察不同组分培养基中细菌形态,将不同组分培养基中获得的混合培养物划线固体平板培养基并培养、观察菌落形态及菌落气味,采用16SrDNA测序技术评价不同组合培养基对艰难梭菌的纯化效果。结果:艰难梭菌抗生素抗性实验结果显示,艰难梭菌对氯霉素、克拉霉素和氨苄青霉素敏感,对四环素、D-环丝氨酸和头孢西丁具有抗性;在相同艰难梭菌接种量条件下,不同生产厂家BHI-酵母粉培养基(BHIS)均有艰难梭菌典型的沉淀生成,并伴有浓烈臭鸡蛋气味;显微镜观察发现纯化前艰难梭菌与粪肠球菌共培养物有大量球菌和链球菌、少量杆菌;BHIS-BDC培养基所有视野中无球菌,仅见杆状细菌;BHIS培养基上艰难梭菌仅在平板边缘形成零星菌落,BHIS-BDC培养基表面形成典型艰难梭菌菌落;16SrDNA测序结果表明1~2mm菌落为粪肠球菌,3~5mm菌落为艰难梭菌。结论:不同生产厂家的BHIS培养基对艰难梭菌中粪肠球菌的去除没有明显差异,BHIS培养基中添加羊血、D-环丝氨酸与头孢西丁复合抗生素可去除艰难梭菌中粪肠球菌污染。

敲除PaLoc毒力岛的无毒性艰难梭菌菌株的构建

目的:使用CRISPR-Cfp1系统敲除艰难梭菌毒性(PaLoc)毒力基因岛,构建无毒性艰难梭菌菌株。方法:使用分子克隆方法,构建针对PaLoc毒力岛的基因打靶质粒pWH53;将pWH53质粒转化艰难梭菌630菌株后,诱导Cpf1蛋白表达,PCR筛选发生双交换的PaLoc敲除突变株,测序验证设计位点是否发生等位双交换。结果:PCR结果显示,获得的16株转化子中有8株为敲除PaLoc突变株,阳性率为50%;测序结果显示,获得的8株敲除PaLoc突变株均在设计位点发生了等位双交换。结论:成功构建艰难梭菌毒性毒力岛敲除PaLoc突变株。

连续血液净化对脓毒症患者的IL-6、TNF-α及PCT水平的影响

目的:探讨连续血液净化(CPB)对脓毒症患者的白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及降钙素原(PCT)水平的影响及疗效。方法:75例脓毒症患者,根据治疗方式均分为CPB组(连续血液净化治疗72 h)、IHD组(间断血液透析治疗、8 h/d、共3 d)及对照组(未进行血液净化治疗),分别于治疗前及治疗72 h时检测3组患者血清IL-6、TNF-α及PCT水平,比较治疗72 h时3组患者的机械通气时间、住院时间及住院28 d时的存活率。结果:治疗前,3组患者血清IL-6、TNF-α及PCT水平比较,差异无统计学意义(P> 0. 05);治疗72 h时,CPB组、IHD组血清IL-6、TNF-α及PCT水平低于对照组及同组治疗前(P <0. 05);治疗72 h时,CPB组机械通气时间、住院时间较IHD组及对照组缩短(P <0. 05); CPB组28 d住院存活率明显高于IHD组及对照组(P <0. 05)。结论:CPB能有效提高脓毒症患者的存活率,其机制可能与CPB清除血液炎症介质有关。

艰难梭菌黏附因子研究进展

艰难梭菌是一种机会性致病菌,是导致抗生素相关性腹泻和伪膜性结肠炎的主要病原菌。在艰难梭菌致病周期中,艰难梭菌黏附于肠壁细胞、进一步产生毒素并入侵肠上皮细胞尤为重要,是其致病过程的关键环节。艰难梭菌黏附过程需要多种黏附因子的参与,目前已知的黏附因子有细胞壁结合蛋白(Cwp6、Cwp8、Cwp2)、S层蛋白(SlpA)、细胞表面蛋白(Cwp66)、热休克蛋白(GroEL)、纤维连接蛋白(Fbps)、鞭毛蛋白(FliC、FliD)及脂蛋白(CD0873)等。本文对艰难梭菌黏附因子的研究进展进行综述。