小黄姜组培快繁技术研究

以贵州省六盘水市特产小黄姜茎尖为外植体,进行了组织培养快速繁殖技术研究。结果表明:消毒时间对茎尖成活率影响很大,以0.1%HgCl_2消毒15 min最有效。筛选出了不定芽分化的最适培养基(MS+6-BA 3.5mg/L+NAA 0.1 mg/L),实现了小黄姜的继代和增殖同步化,组培苗移栽到营养土与珍珠岩为3∶1的混合基质中生长,成活率达到94%。

不同品种头花蓼叶片的比较解剖学研究

[目的]对野生头花蓼、GAP基地种植头花蓼、贵州省农业生物工程重点实验室选育的四倍体及其二倍体头花蓼品种叶片进行解剖学研究,期望为头花蓼优良品种的选育提供解剖学参考依据。[方法]采用石蜡切片法和指甲油印迹法,分别对4种头花蓼叶片结构和叶表皮进行观测。[结果]头花蓼叶片气孔器为无规则型,上表皮气孔数明显少于下表皮。表皮毛仅分布于叶脉上,下表皮相对较多。叶肉包括栅栏组织和海绵组织2个部分,其中栅栏组织2列,细胞呈长柱形;海绵组织细胞近圆形,排列疏松。叶脉为外韧维管束类型,主脉具两个维管束,上下排列,近轴面维管束较小,其韧皮部朝下,木质部朝上;远轴面维管束相对较大,木质部和韧皮部的排列与近轴面维管束相反。[结论]在研究的4个头花蓼材料中,与其他3个二倍体品种相比,多倍体形态解剖结构特征有明显差异。四倍体品种气孔密度较小,叶片较厚,栅栏组织发达,表明该品种具有较强的抗寒性,对环境的适应能力更强。

绿茶抑菌成分提取工艺优化研究

为了实现多指标筛选绿茶中抑菌成分,对其提取工艺进行了优化。以3个贵州特色茶树品种(黔茶1号、黔湄419、黔湄601)夏季的一芽三叶为原料,福鼎大白茶为对照,分别加工成绿茶,采用双层平板法比较抑菌活性,并测定各提取物活性成分的含量,以相关成分的含量为指标设计正交试验研究提取工艺。结果表明,4个茶树品种绿茶甲醇提取物与水提取物共8个样品均表现出一定的抑菌效果,其中黔茶1号绿茶醇提取物的抑菌效果最佳。相关性分析表明,与抑菌作用呈相关关系的成分有总酚、总黄酮、儿茶素类、EGCG、ECG和EC。以上述6种成分为指标,最佳的提取工艺条件为:浸提时间12 min,浸提温度70℃,料液质量体积比1∶25,甲醇体积分数75%。3次平行验证RSD值均在5%以内。综上所述,本研究优选出的甲醇提取工艺条件科学合理、简单可行,可为黔茶1号的进一步研究和生产抑菌产品提供理论依据。

NtQPT基因对烟草形态及光合特性影响的研究

本研究以含CaMV 35S启动子启动烟草QPT超量表达载体pSH-35S-QPT和含CaMV 35S驱动烟草QPT干涉表达的植物表达载体pSH-35S-QPTi的工程农杆菌分别对烟草进行遗传转化。通过对不同生育期2种转基因烟草形态及光合测定发现,QPT干涉表达烟草的株高、茎围等形态指标均显著低于QPT超量表达和野生型植株。其中,以旺长期转干涉片段35 S∷QPTi转基因烟草植株的株高、茎围指标差异最为显著(p<0.01),分别比野生型和超量表达植株低31.77%、27.51%和42.0%、36.78%。此外,干涉植株的开花时间比野生型和超量表达烟草延迟10~15d。干涉植株的最大净光合速率分别比野生型和超量表达植株低40.26%和44.51%,差异均达到显著水平(p<0.05)。另外,干涉植株的叶绿素a和类胡萝卜素含量也出现显著降低,为野生型的71.07%和72.80%。

杜仲性别相关EST-SSR标记的开发

【目的】杜仲为雌雄异株多年生木本植物,具有重要的药用价值与经济价值,其利用价值因植株性别而异,尤其是杜仲胶含量及其他次生代谢产物在雌雄植株中都存在差别,但杜仲在开花前采用形态学和细胞学方法很难分辨其性别,且需要7年以上才能开花。因此,本研究应用EST-SSR标记开发杜仲性别相关的分子标记,以期能在早期鉴定出雌雄植株,提高杜仲资源利用率。【方法】根据杜仲雌雄植株转录组文库中EST-SSR的两翼序列设计引物,利用来源于7个产地的杜仲雌雄植株各6份DNA样品筛选引物,PCR扩增获得具性别差异的扩增产物,将扩增产物进行克隆及序列分析,应用雌雄植株各12份DNA样品检验性别标记的可靠性。【结果】从140对EST-SSR引物中筛选出1对引物EST-Eu059,在雌、雄植株中产生差异条带,雌、雄植株均有1条约160 bp的序列(分别命名为Eu-f160和Eu-m160),而雄株多1条约120 bp的序列(Eu MSM)。序列分析发现,Eu-f160与Eu-m160均为156 bp,具有重复单元(GT)6,且仅有1个碱基不相同,即雌株重复单元内第3个G碱基变成了A,可能发生了突变;Eu MSM为112 bp,缺失了(GT)6重复单元。经Blastn比对,Eu MSM序列与Gen Bank数据库中的现有序列没有同源性。用杜仲雌、雄植株基因组DNA各12份进行验证表明,在所有雄株中都有1条雄性特异序列。【结论】本研究筛选出了1对可以鉴别杜仲雌雄株性别的引物EST-Eu059,该标记在雄株中具有1条特异序列片段Eu MSM。该标记可在杜仲生长早期快速、可靠地鉴定其性别。

朝仓花椒叶水浸提物对白菜种子萌发及幼苗生长的影响

就朝仓花椒(Zanthoxylum piperitum DC.var.inerme Makino)叶水浸提物对4种白菜种子萌发和幼苗生长的影响进行了研究。结果表明,花椒叶水浸提物显著抑制白菜种子萌发和幼苗生长,且水浸提液浓度越高,抑制作用越强。水浸提液稀释4倍,白菜幼苗生长仍受到显著抑制,过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著降低,丙二醛(MDA)含量显著增高。说明白菜萌发及幼苗生长受到抑制是由于白菜幼苗的酶系统遭受破坏所致。

杜仲雌雄株转录组测序数据组装及基因功能注释

以10年以上树龄的杜仲雌株当年新发枝条上的幼果、嫩芽、叶片和树皮和雄株新发枝条上嫩芽、叶片和树皮为材料,采用Illumina Hi SeqTM2000高通量测序技术进行转录组测序,获得雌株51,574,000条、雄株52,430,502条Clean Reads数据,分别包含总长度为4,641,660,000nt和4,718,745,180nt核苷酸序列数据信息;经拼接组装,获得雌株基因信息长达69,461,730nt的423,339个Contig片段,获得雄株基因信息长达94,814,201nt的542,383个Contig片段;经进一步拼接,分别获得平均长度为288nt的雌株159,434个Unigene片段和平均长度为231nt的雄株257,288个Unigene片段,共有48,761个表达序列标签(EST)。以BLAST(E-value1.0E-5)将Unigene对NR、NT、KEGG和COG数据库进行比对,获得CDS序列35,541条,再通过ESTscan分析获得CDS片段13,220条,共获得48,761条CDS片段。与NR数据库比对发现杜仲雌、雄株转录组Unigene与葡萄相似序列最多(33.8%),其次是蓖麻(11.4%)和杨树(11.2%),与拟南芥的相似序列仅2.3%;根据Unigene与COG数据库比对结果,可将有COG功能的7,571条Unigene分为24类,而根据GO数据库注释,杜仲转录组有GO功能注释的23,314条Unigene可分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类55分支。与KEGG数据库比对,杜仲雌、雄株转录组17,468条Ungenes分属128类代谢通路,其中有2,399条属于次生物质代谢途径,314条参与萜类化合物生物合成途径。

转录组测序分析甘蓝型油菜DW871矮化性状

DW871是一个具有特异株型的甘蓝型油菜矮化品系。为了研究DW871的相关基因及其表达模式,我们以甘蓝型高秆油菜HW871为对照,选取抽薹期茎秆组织进行转录组基因表达分析。结果显示:DW871与HW871之间存在8665个显著差异基因,其中上调基因2582个,下调基因6083个。通过GO富集分析可注释到3个大类共22个亚类中。通过KEGG富集分析注释到5个大类31个亚类共295个通路中。我们从显著差异基因中筛选了与矮化性状密切相关的基因,在果胶降解代谢途径中注释到了43个差异基因;在生长素信号转导途径中注释到了69个差异基因;在木质素单体合成途径中注释到22个差异基因。发现DW871的矮化性状与细胞伸长、细胞壁形成和细胞分裂的异常以及生长素信号传导的受阻有关。尤其在木质素单体合成途径中的,可能通过调控PAL和CCR等酶的表达,改变木质素的合成速率和组成,进而对一系列与木质素相关的生理生化过程进行调控。因此提出DW871的矮化机制,即生长素应答和木质素合成的异常,造成了细胞伸长、生长和细胞壁变化的异常,并最终导致了DW871的矮化。

黄花蒿bHLH转录因子基因家族鉴定及光调控分析

目的:基于黄花蒿全基因组及转录组数据,进行AabHLH基因家族生物信息学分析及在不同光处理下的基因表达分析。方法:基于基因隐马科夫模型(HMM)对AabHLH基因进行鉴定,利用Pfam、GSDS、MEME等在线分析软件对基因结构、分子进化及保守结构域等进行分析。结果:全基因组水平共鉴定出99条黄花蒿AabHLH基因,包含49对复制基因对;基于系统发育树将其分为13个亚族,所有亚族AabHLH蛋白亚细胞定位于细胞核且均为亲水性蛋白,同一亚族基因具有相似的外显子-内含子结构及保守基序。基因表达模式分析发现,AabHLH基因在不同水平上响应蓝光、红光、远红光、白光调控,推测其中6个亚族基因为光照条件下,7个亚族基因为非光照条件下青蒿素合成途径调控基因。结论:在全基因组水平鉴定了AabHLH基因,为深度解析AabHLH基因功能及其对光调控下青蒿素生物合成调控机制提供参考。

不同加工工艺对刺梨叶茶品质和化学成分的影响

本实验采用了3种制茶加工工艺对刺梨幼嫩鲜叶进行加工,其中绿茶采用3种杀青方法。如微波杀青、滚筒杀青和蒸汽杀青,分析其在感官品质和主要化学成分方面的差异。结果表明,刺梨幼嫩鲜叶制备的刺梨红茶整体最佳,其外观色泽乌黑油润,匀整,有嫩香气,茶汤滋味醇厚鲜美,没食子酸、胡萝卜苷和芦丁在红茶中含量最高;同时,对刺梨叶茶中黄酮的DPPH自由基清除能力进行分析,发现,红茶(76.16%)>绿茶微波杀青(75.86%)>白茶(75.57%)>绿茶蒸汽茶青(71.67%)>绿茶滚筒杀青(71.58%)。因此,刺梨幼嫩鲜叶最适制刺梨红茶,这将为刺梨叶茶及保健类茶加工提供有力的参考依据。

橡胶合酶基因TkCTP1异源表达对杜仲胶合成的影响

本研究通过农杆菌介导的遗传转化法转化杜仲,经PCR验证获得独立的杜仲转基因株系76株。代谢组学分析结果表明,转基因杜仲与野生型杜仲差异代谢物共有58个,其中有43个上调、15个下调;与杜仲胶生物合成相关的差异代谢物有7个,包括上调的两个单萜和下调的甲羟戊酸、D-赤藓糖-4-磷酸、1个半倍萜和2个三萜。野生型和转基因杜仲胶的结构检测结果显示,转基因杜仲与野生型杜仲都存在反式-1,4-结构的特征峰,而转基因杜仲在1351 cm-1和830 cm-1外有峰出现,是否代表顺式-1,4-异戊二烯结构还有待进一步验证。

转杜仲几丁质酶基因EuCHIT1番茄提高对灰霉病的抗性

通过农杆菌介导法将杜仲几丁质酶基因EuCHIT1遗传转化‘Micro-Tom’番茄,经筛选和PCR鉴定获得38株转基因植株。对野生型和转EuCHIT1番茄几丁质酶活性、灰霉病抗性、保护酶活性以及病程相关蛋白基因表达水平等进行分析,结果表明,转EuCHIT1番茄植株几丁质酶活性为2 059.48 U·g^(-1)(FW),较野生型高62.14%,差异达到极显著水平。对野生型和转EuCHIT1番茄植株接种灰霉菌后,转EuCHIT1番茄发病时间比野生型推迟3 d。分别对未接种和接种灰霉菌6 d后的野生型和转EuCHIT1番茄SOD、POD、CAT活性和MDA含量分析表明,接菌前,转EuCHIT1番茄植株中POD活性为2 825.85 U·g^(-1)(FW),比野生型高48.63%;MDA含量为21.84 nmol·g^(-1)(FW),比野生型低28.25%;而SOD和CAT活性与野生型相比无显著差异。接菌后,转EuCHIT1番茄植株中SOD、POD和CAT活性分别为510.44、5 423.92和603.59 U·g^(-1)(FW),分别比野生型高19.48%、116.08%和53.80%;MDA含量为26.49 nmol·g^(-1)(FW),比野生型低37.65%。说明EuCHIT1基因表达增强了番茄植株的抗氧化能力,从而减少灰霉病对番茄的损伤。病程相关蛋白基因表达分析表明,接菌前,转EuCHIT1番茄中PR^(-1)a、PR-2和PR-5基因表达量均高于野生型,分别为野生型的2.23、11.69和1.80倍,PR-NP24表达量与野生型无显著差异;接菌后,转EuCHIT1番茄的PR^(-1)a、PR-2、PR-NP24和PR-5表达量均极显著高于野生型,分别是野生型的4.35、10.37、16.58和5.02倍。上述研究结果说明,转EuCHIT1基因番茄提高对灰霉病抗性,与保护性酶活性提高以及病程相关蛋白基因表达上调有关。

烟草NtNAC1基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析

NAC转录因子在植物信号转导及非生物损伤过程中起重要作用。本实验从烟草c DNA文库中克隆了NtNAC1基因,c DNA编码区全长861 bp,编码286个氨基酸。进化树分析结果显示,Nt NAC1基因编码的氨基酸序列与马铃薯同源性最高。农杆菌介导的遗传转化获得37株转基因烟草,用20%PEG6000处理转基因和野生型植株7 d。结果显示,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的酶活性都高于野生型,丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量都低于野生型。RT-PCR分析结果显示,Nt NAC1基因以及Nt NAC基因表达高于野生型,脯氨酸合成的2个关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸-δ-氨基转移酶(δ-OAT)基因表达低于野生型。选取T_0代转基因和野生型种子,对苗期根系进行耐旱性分析。结果发现,在300 mmol·L^(-1)甘露醇胁迫下,转基因根系比野生型长,野生型根系的生长明显受到抑制。这表明转Nt NAC1基因的表达可能提高了植株的抗旱能力。

超量表达AtBAS1基因对烟草中烟碱和降烟碱合成的影响

为明确拟南芥(Arabidopsis thaliana)光敏色素B激活标签的抑制蛋白1(phy B activation-tagged suppressor1,BAS1)基因对烟草(Nicotiana tabacum)中烟碱、降烟碱和N-亚硝基降烟碱合成的影响,通过构建含有不同启动子的植物表达载体p SH-p LXM5-BAS1和p SH-35S-BAS1遗传转化烟草。在8~10叶期分别取转基因和野生型烟草植株相同部位的叶片,采用LC-MS方法对样品中烟碱、降烟碱、亚硝基降烟碱含量进行测定,结果表明转基因烟草烟碱含量和降烟碱含量与野生型相比均明显提高。转p LXM5-BAS1基因和转35S-BAS1基因植株烟碱含量分别是野生型植株2.9倍和2.95倍;同时测得降烟碱含量分别为野生型的3.35倍和3.76倍;在转基因和野生型烟草中均未检测到亚硝基降烟碱。表明超量表达At BAS1对烟草的烟碱和降烟碱合成存在显著影响。据NCBI数据库中报道的烟碱合成相关基因PMT和QPT,降烟碱合成相关基因CYP82E4v1、CYP82E5v2、CYP82E10的序列,设计各基因的Real-time PCR引物,并以烟草β-Actin基因作为内参,Real-Time PCR结果表明烟碱和降烟碱合成相关基因表达均出现不同程度的上调。综上可知,在烟草中超量表达At BAS1基因,促使烟碱和降烟碱合成相关基因表达的上调,直接导致了烟草中烟碱含量和降烟碱含量的大幅提高。本研究为后续深入挖掘影响烟碱及降烟碱生成及转化的新基因并最终构建完整的烟碱代谢网络提供了借鉴,也为研究烟碱向降烟碱转化过程中信号因子和信号传递提供了一个新途径。