多星韭AwCHI 1的克隆与分析及真核表达载体的构建

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮物质合成途径中的关键酶,能催化柚皮素查尔酮生成柚皮素,进而转化生成各种类型的黄酮类化合物。根据多星韭(Allium wullichii)转录组测序结果,运用PCR技术克隆获取多星韭查尔酮异构酶的编码基因(AwCHI 1),对基因序列进行分析,同时与真核表达载体pBI121进行连接,将其转入农杆菌GV3101感受态细胞中,完成农杆菌的转化。研究结果不仅为该基因的功能解析研究奠定了基础,也为多星韭类黄酮代谢途径的研究提供了重要基因资源。

贵州陆生贝类物种多样性及地理分布

基于已有的贵州陆生贝类标本数据,结合2019年7月至2020年12月对贵阳、荔波和习水等地的调查结果,整理得出贵州陆生贝类2亚纲4目20科76属316种及亚种(含13个未定种)。从种类组成看,贵州陆生贝类以环口螺科(Cyclophoridae)种类最丰富,有16属71种;巴蜗牛科(Bradybaenidae)次之,有15属61种;树螺科(Helicinidae)和槲果螺科(Cochlicopidae)均为1属1种;优势种为洞穴恰里螺(Kaliella cavicola)、同型巴蜗牛(Bradybaena similaris)、弯倍唇螺(Diplommatina herziana)、缝合倍唇螺(Diplommatina consularis)、矮小双边凹螺(Chamalycaeus nanus)和假穴环肋螺(Plectotropis pseudopatula)。从分布上看,贵州陆生贝类以黔中中亚热带湿润溶丘山原区种类最为丰富,有17科54属170种;黔南中亚热带湿润山原斜坡中低山区和黔西南亚热带半湿润丘原中山区次之,分别有18科56属152种、17科57属150种;黔东温热湿润中低山丘陵区最少,仅有10科18属27种。贵州省不同区域物种相似性分析表明,黔南中亚热带湿润山原斜坡中低山区、黔北中亚热带湿润山原斜坡中低山区、黔西南亚热带半湿润丘原中山区陆生贝类物种组成比较相似,黔东温热湿润中低山丘陵区与其他区域种类组成相差较远。

贵州青钱柳膜结合转录因子CpMTF9的基因克隆及功能鉴定

NAC转录因子作为植物最大的转录因子家族之一,当植物遭到逆境时,会通过一系列应激反应将调控信号逐级放大,促进NAC转录因子与启动子结合调控相关基因的表达,以增强细胞胁迫应答能力。

植物细胞器中蛋白质质量控制的研究进展和未来展望

内质网、叶绿体和线粒体是植物中主要的蛋白质合成、光合作用、代谢和能量产生的细胞器。蛋白质折叠是一个容易出错的过程,同时受到发育信号和环境条件的影响。当非原生构象蛋白积累时,细胞器特异性的未折叠蛋白通过减少蛋白折叠需求,增加蛋白折叠能力来响应并恢复稳态蛋白。文章综述了近年来在植物内质网、叶绿体和线粒体中蛋白质质量控制方面的研究进展,介绍了这些细胞器在蛋白质稳态过程中所具有的共同机制。

马缨杜鹃查尔酮异构酶(RdCHI1)重组蛋白的制备及功能验证

【目的】制备马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因表达的重组蛋白并验证其活性,为解析查尔酮异构酶功能提供理论依据,为改良植物花色、增加药用成分奠定基础。【方法】根据所获得的马缨杜鹃查尔酮异构酶RdCHI1基因的序列信息设计引物,构建其原核表达载体,优化RdCHI1可溶性重组蛋白最佳诱导表达条件,制备可溶性重组蛋白并检测其活性。【结果】成功构建RdCHI1原核表达载体,RdCHI1重组蛋白可在上清中表达,最佳诱导条件为:15℃、36 h,IPTG浓度0.35 mmol·L^(-1)。经镍柱纯化得到质量较好的RdCHI1重组蛋白,通过体外酶活反应确定,与对照组相比,RdCHI1可以更快地催化柚皮素查尔酮(Naringenin chalcone)反应生成柚皮素(Naringenin)。【结论】RdCHI1为I型CHI,可极大提高柚皮素查尔酮生成柚皮素的速率,增加黄酮类物质积累量。

日本蛇根草OjDFR5基因的克隆与真核表达载体的构建

二氢黄酮醇4-还原酶具有明显的底物特异性,是类黄酮代谢途径中的关键酶,对不同花青素的合成与积累起到决定作用,直接影响植物的颜色性状。日本蛇根草是一种具有较好药用价值的研究材料。通过分子生物学方法克隆获得日本蛇根草中的二氢黄酮醇4-还原酶的编码基因,OjDFR5,并对该基因的序列进行分析,同时将其与真核表达载体pBI121进行连接,获得真核重组表达质粒pBI121-OjDFR5,并将重组质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中。研究结果一方面为该基因的功能解析奠定基础,同时也为探究日本蛇根草类黄酮代谢机制研究提供基因资源。

马缨杜鹃RdDFR1基因的克隆分析与可溶性重组蛋白的制备

二氢黄酮醇4-还原酶位于类黄酮代谢途径下游,可催化二氢黄酮醇转化为对应的花色素苷,因具有底物特异性,直接影响植物颜色的呈现。通过PCR法克隆得到马缨杜鹃DFR1基因(RdDFR1),序列分析显示,RdDFR1不具有信号肽,定位在细胞质膜的可能性最大,与越桔DFR的亲缘关系最近。随后,将RdDFR1与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET-32a(+)-RdDFR1,并转入大肠杆菌BL21感受态细胞中。诱导表达分析显示,重组蛋白最佳诱导表达条件为:IPTG浓度为0.25 mmol/L,15℃下诱导48 h。按照上述条件制备并纯化得到了符合实验要求的重组蛋白,为研究RdDFR1的生物学功能及性质奠定了基础。

马缨杜鹃Rd3GT1的克隆及对矮牵牛花色形成的影响

类黄酮3-O-糖基转移酶(3GT)是花色素苷生物合成途径末端的酶,负责将糖基供体转移至花青素的3-OH位置,在增加花色素苷的稳定性与水溶性方面发挥重要作用。研究马缨杜鹃3GT在花色素苷生物合成中的功能,为马缨杜鹃花色形成及调控研究奠定基础。运用 RT-PCR 技术克隆获得马缨杜鹃3GT基因(Rd3GT1)全长CDS序列,并对其进行生物信息学分析,再利用DNA重组技术完成植物表达载体pBI121-Rd3GT1的构建,利用农杆菌介导法对矮牵牛进行遗传转化,同时对再生植株进行转基因及表型鉴定,并完成基因表达量及花色素苷检测分析。结果表明,Rd3GT1全长CDS序列为1 395 bp,编码464个氨基酸。蛋白多序列比对和系统进化分析表明,Rd3GT1属于3GT家族成员。与野生型相比,转Rd3GT1的矮牵牛植株花色由白色变为粉色,花色素苷与黄酮醇的积累显著增加,同时多个类黄酮合成相关基因表达显著升高。综上,Rd3GT1在花色素苷合成过程中发挥重要功能,可用于其它植物花色改良研究。

马缨杜鹃Actin基因片段的克隆及序列分析

为研究马缨杜鹃相关功能基因的表达模式提供内参基因,本研究根据Gen Bank中公布的锦绣杜鹃肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计引物,以马缨杜鹃c DNA为模板,利用RT-PCR方法克隆得到马缨杜鹃Actin基因部分c DNA片段,将其命名为Rd Actin。结果显示:该基因片段长度为468 bp,编码156个氨基酸;保守域分析表明该基因具有Actin的功能保守域,同时Rd Actin与其它植物Actin的氨基酸序列同源性达97%以上。

日本蛇根草Actin基因片段的克隆及其序列分析

为研究日本蛇根草功能基因的表达提供内参基因,笔者参照GenBank中桔梗的肌动蛋白基因(Actin)序列设计引物,以日本蛇根草的cDNA为模板,通过RT-PCR方法成功克隆获得日本蛇根草Actin基因片段,并将其命名为OjActin(OjActin片段长469 bp)。功能保守域分析显示OjActin归属于Actin超家族,与其他植物Actin的氨基酸序列同源性达94%以上;系统进化树分析显示,OjActin与咖啡的亲缘关系最近。

基于线粒体基因分析黑颈鹤和灰鹤的遗传差异

种群的遗传差异和遗传结构是确定保护等级和保护管理单元的基础,采用黑颈鹤和灰鹤的粪便作为DNA样品来源。通过对粪便DNA进行COI基因的扩增,结合从Gen Bank上下载的两种鹤的COI序列,对其进行遗传差异分析,发现黑颈鹤和灰鹤群体的COI基因变异很小,几乎为零,建议加强保护力度。通过对两种鹤的线粒体基因组各基因的变异位点比例分析,发现CR和Cytb两个基因变异位点所占比例相对于其他基因较高,考虑作为黑颈鹤和灰鹤种群遗传学研究的最优分子标记。研究结果将为黑颈鹤和灰鹤保护策略的制定提供科学依据,为鹤属分子系统学和分子粪便学研究奠定基础。

高纯度金钗石斛生物碱提取工艺的开发

通过设置不同pH、温度、酶解时间、酶用量和乙醇浓度等梯度条件,确定酶法提取生物碱的最适条件为酶用量7 mg酶/g石斛粉、缓冲液pH=5、酶解温度40℃、酶解时间2 h;提取条件在75%的乙醇、固液比为1∶12,碱化后在pH=8时,效果最好。将乙醚重结晶3次母液合并,以20 kg石斛作为原料,可获得20 g以上纯度为98.4%的产物,经气质联用法(GC-MS)鉴定提取物为石斛碱。结论:酶法提取生物碱的效果较好,可用于金钗石斛总生物碱的分离纯化。该方法简单快速,稳定高效,具有潜在工业生产价值,为金钗石斛总生物碱的工业化生产提供了实验依据。

花色苷的生物合成及其影响因素研究进展

花色苷是一种天然的水溶性色素,常分布于植物的花、果实、茎、叶细胞中,能赋予植物丰富的色彩。花色苷对植物具有重要的生理生态功能,能帮助植物适应和抵御不良环境,对人类还具有疾病预防和保健作用。研究结果证明,花色苷的生物合成至少需要苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟基化酶(F3H)、类黄酮-3′-羟化酶(F3′H)、类黄酮-3′,5′-羟化酶(F3′5′H)、二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)、花色素合成酶(ANS)、类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)等酶共同参与,同时受内在因素与外在因素的共同调控,本文重点从花色苷生物合成及影响因素两方面进行综合评述,为花色苷的生物合成及开发和利用研究提供基础。

日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。

铁皮石斛花青素合成酶基因的生物信息学分析

花青素合成酶(ANS)是花青素合成途经中的关键酶,可催化无色花色素转变成有色花色素。本文从NCBI数据库中获取铁皮石斛花青素合成酶基因(DoANS)的cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因进行了分析。分析结果表明:该基因完整的开放阅读框长1077 bp,共编码358个氨基酸,其中亮氨酸含量最高,占氨基酸总数的10.9%,半胱氨酸含量最低,占氨基酸总数的1.1%。理化性质分析表明,DoANS蛋白分子质量为39.59 kD,属于亲水性蛋白,理论等电点为5.42,无信号肽,主要分布于细胞质中;二级结构中无规则卷曲占比59.78%,延伸链占比15.08%,同时蛋白三级结构分析结果与之相符。最后,系统进化分析显示,DoANS与大花惠兰ANS的亲缘关系最近。

OjCHI真核表达载体的构建及农杆菌的遗传转化

查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是类黄酮生物合成途径中的第二个关键酶,在类黄酮合成与积累过程中发挥着至关重要的作用。笔者以日本蛇根草为材料,在克隆获得其CHI基因(OjCHI)的基础上,将该基因插入由35S启动子控制的真核表达载体pBI121,完成重组表达质粒pBI121-OjCHI的构建,同时利用冻融法将重组质粒成功转入农杆菌GV3101。该实验的完成可为下一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定基础。

金钗石斛查尔酮合酶基因的生物信息学分析

利用生物信息学工具及方法对金钗石斛查尔酮合成酶基因进行分析。结果显示,金钗石斛查尔酮合酶基因(DnCHS)完整的CDS为1 188 bp,共编码395个氨基酸,蛋白分子量为43.10 kD,理论等电点为6.22,且该蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,很可能定位在细胞质中。同时,蛋白质二级和三级结构的分析表明,DnCHS蛋白由33.92%的α螺旋,8.35%的延伸链以及57.72%的无规则卷曲组成。系统进化分析显示,DnCHS与红掌的亲缘关系最近。

基于线粒体COX1基因探讨夜鹭的分歧时间

物种分化过程与原因是进化生物学和生态学研究的热点问题之一,分化的本质为基因的分化。研究采用全球分布的夜鹭作为研究对象,基于线粒体COX1基因,分别采用贝叶斯法和最大似然法构建其系统发育树;采用放松分子钟的方法,利用鹳形目与鹈形目的分歧时间结点68.92百万年,与企鹅目的分歧时间67.12百万年,及鹈形目与企鹅目的分歧时间72.25百万年作为校正点,使用BEAST软件构建其分歧时间树,目的是利用分子手段探究夜鹭的分歧时间,并尝试推测其可能的分化因素。结果表明:夜鹭可依分布区域而分为两个支系,亚洲支系和美洲支系;距今56.74百万年左右,两支系分开;分歧原因可能与亚洲大陆和美洲大陆的分离有关。

锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因的生物信息学分析

类黄酮-3′,5′-羟基化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)是类黄酮代谢途径的一个关键酶,能使花色素的合成方向趋向于蓝色的飞燕草素。利用生物信息学软件对锦绣杜鹃类黄酮-3′,5′-羟基化酶基因(RpF3′5′H)进行分析。结果显示,RpF3′5′H基因ORF长1551 bp,共编码516个氨基酸;分子量为57.31 kD,等电点为9.03,无信号肽,定位于细胞质中的可能性最大,二级结构与三级结构中含有较多的α螺旋,与高丛越橘有较高亲缘性。分析结果将对RpF3′5′H的功能解析奠定理论基础,同时也为探究锦绣杜鹃花色苷的生物合成有一定指导作用。

秧鸡科部分鸟类线粒体基因组的比较及系统发育关系分析

秧鸡科鸟类的系统发育关系尚不明确,本研究通过对秧鸡科11属共17种鸟类的线粒体基因组中各基因进行变异位点和简约信息位点分析。选取变异位点和简约信息位点含量均较高的CR、ND2、ND4、ND5及线粒体基因组分别作为分子标记,采用NJ法、ML法和贝叶斯法分别构建系统发育树。通过对各系统树进行比较分析,结果表明:红胸田鸡、小田鸡、紫水鸡、南秧鸡、黑水鸡、白骨顶鸡、新西兰秧鸡、粟腹秧鸡、红眼斑秧鸡、冲绳秧鸡和奥岛秧鸡的系统发育关系明确;考虑将董鸡属划入苦恶鸟属、粟腹秧鸡划入到纹秧鸡属;支持侏秧鸡科独立成科;完整的线粒体基因组是解决秧鸡科鸟类系统发育关系的最优分子标记。研究结果将为后续增加种属,进一步解决秧鸡科鸟类的系统发育关系提供指导。