红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3的克隆及功能鉴定

为了解α-淀粉酶在红肉火龙果〔Hylocereus polyrhizus(F.A.C.Weber)Britton et Rose〕果实淀粉降解中的作用,对红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3进行克隆和生物信息学分析,检测果实发育期间该酶的活性及其编码基因的表达,同时对HpAMY3重组蛋白的淀粉降解活性进行分析。结果表明:HpAMY3基因的开放阅读框长度为2742 bp,编码913个氨基酸;HpAMY3蛋白的理论相对分子质量为102370,理论等电点为pI 6.02,预测此蛋白位于叶绿体,且为亲水性蛋白。系统进化分析表明HpAMY3与拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕AtAMY3的亲缘关系最近,均属于AMYⅢ类。亚细胞定位实验结果显示HpAMY3定位于本氏烟草(Nicotiana benthamiana Domin)叶片的叶绿体,表明HpAMY3具有质体定位的特点。在授粉后20和23 d,红肉火龙果果实的α-淀粉酶活性较低;在授粉后25 d,α-淀粉酶活性显著(P<0.05)升高;在授粉后27和30 d,α-淀粉酶活性保持在较高水平。红肉火龙果果实的HpAMY3基因相对表达量在授粉后20和23 d较低,在授粉后25和27 d持续升高,在授粉后30 d略有降低。红肉火龙果果实发育期间α-淀粉酶活性与HpAMY3基因相对表达量的相关性较高(R^(2)=0.94)。体外淀粉降解活性实验结果显示:在含有HpAMY3重组蛋白的反应体系中均检测到麦芽糖和麦芽三糖,且二者含量极显著(P<0.01)高于含有载体对照pDR196的反应体系。综合上述结果,HpAMY3蛋白可能定位于红肉火龙果果实的淀粉体;在果实发育期间,HpAMY3基因上调表达,HpAMY3具有淀粉降解活性。