猪呼吸道病原菌多重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速诊断由猪链球菌(SS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(App)、猪多杀性巴氏杆菌(Pm)、副猪嗜血杆菌(Hps)、猪支气管败血波氏杆菌(Bb)和猪肺炎支原体(Mhp)单独或混合感染引起的猪呼吸道疾病的检测方法,基于上述6种病原菌对应的gdh(SS)、apxⅣA(App)、KMT1(Pm)、16S rRNA(Hps)、fla(Bb)和p36 ldh(Mhp)基因设计特异性引物,通过优化各反应条件建立了能同时检测SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp的多重PCR方法。结果显示,该方法特异性强,仅对SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp有特异性扩增,对大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌等其他病原菌的扩增结果均为阴性;敏感性较高,对6种病原菌DNA的最低检出限分别为SS 8.66×10^(2)拷贝/μL、App 1.05×10^(4)拷贝/μL、Pm 8.61×10^(2)拷贝/μL、Hps 9.01×10^(2)拷贝/μL、Bb 7.54×10^(2)拷贝/μL、Mhp 3.86×10^(3)拷贝/μL。利用该多重PCR和各单项PCR分别检测贵州省9个市(州)部分猪场的469份临床样品,结果显示,多重PCR阳性检出率为App 0.85%(4/469)、Pm 15.35%(72/469)、SS 59.49%(279/469)、Hps 52.67%(247/469)、Mhp 6.40%(30/469)、Bb 5.12%(24/469)。混合感染主要以SS和Hps为主,阳性检出率为30.92%(145/469),其次是Pm、SS和Hps混合感染,阳性检出率为7.04%(33/469),其他混合感染情况占比较低。多重PCR和单项PCR的总阳性符合率为96.76%。结果表明,建立的多重PCR检测方法为SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp混合感染的临床快速检测及流行病学调查提供了技术支持。

一株猪源葡萄球菌的分离鉴定与耐药性分析

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种无芽胞、无鞭毛的革兰氏阳性菌,显微镜下似葡萄串状,直径0.5~1.5μm,适宜在普通培养基和血琼脂培养基上生长,在麦康凯平板培养基上几乎不能繁殖。该菌广泛存在于大气环境、饲料、食物、水源、场地以及物体表面,对人和畜禽具有一定的致病性,可引发受伤感染、化脓病症、肠内炎症、败血症及毒素作用,可存在于畜禽的表皮、黏膜、大肠、鼻腔及气管,甚至是乳腺中。近年来,金黄色葡萄球菌耐甲氧西林分离株的逐渐增加,耐药性发生变异,临床用药变得复杂化,给临床猪只疫病防治带来了很大的困难,造成了较大的经济损失。

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定、耐药性分析及毒力基因检测

为确定屠宰场发病猪死亡原因,本研究对从死亡猪内脏中分离到的细菌,进行革兰染色镜检、生化鉴定和16S rRNA基因测序鉴定,并进行药敏试验、毒力基因检测及小鼠攻毒试验。结果显示,革兰染色镜检为细小或中等短杆状或丝状革兰阴性杆菌;生化试验特性分析及16S rRNA基因测序鉴定为奇异变形杆菌,命名为GZ2-2株。药敏试验结果显示,分离菌对哌拉西林、头孢呋辛、头孢他啶等11种药物敏感,对卡那霉素和米诺环素2种药物为中敏,对氨苄西林、头孢唑林、四环素等6种药物耐药;毒力基因检测结果显示,该分离菌携带rsbA、atfA、pmfA、mrpA、zapA、ureC、atfC和ucaA 8种毒力基因;小鼠攻毒试验表明,该分离菌有较强致病力。本试验成功分离到一株具有多重耐药性并携带8种毒力基因的奇异变形杆菌,为该菌感染的防治及其分子流行病学研究奠定了基础。