贵州省2012年度禽流感病毒H5N1亚型HA-1基因分析

目的建立并完善贵州省禽流感病毒基因分析检测技术平台,了解贵州省禽流感病毒H5N1亚型HA1片断与WHO公布的流行株比对有否发生变异。方法收集禽流感H5N1亚型病毒毒株,提取病毒核酸RNA,通过RT-PCR扩增HA1片断,用电泳观察PCR产物目的条带大小,经过纯化、测序,用Biodeit、MEGA4相关软件进行序列比对,进行差异性分析,构建系统发育树。结果贵州省禽流感病毒H5N1亚型中鸭来源的禽流感病毒组成一个分支,组内差异性在0.00～5.00之间;鸡来源的禽流感病毒组成另外一个分支,组内高度同源,差异性为零。结论贵州省禽流感病毒在物种之间存在一定的种属特异性。并且与湖南省的禽流感病毒亲缘关系较近,这与两省之间地理交界有关。

贵州省2009年手足口病流行病学分析

手足口病是由多种肠道病毒引起的常见传染病,以婴幼儿发病为主。大部分患者症状轻微,以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹、呼吸道感染、心肌炎,个别重症患儿可发生死亡。重症病例主要是肠道病毒71型（EV71）感染,也有报道感染柯萨奇病毒A组16型等引起的死亡。

贵州省首例人间布鲁杆菌病病例的病原学诊断与分析

目的病原学诊断与分析贵州省1例布鲁杆菌病疑似病例血液中的菌株，为贵州省首例人间布鲁杆菌病的确诊提供实验依据。方法采用传统方法和分子生物学方法[布鲁杆菌属特异性表面蛋白基因PCR（BCSP31-PCR）和布鲁杆菌特异性PCR（AMOS—PCR）法]对从布鲁杆菌病疑似患者血液分离的可疑布鲁杆菌进行鉴定。结果来自布鲁杆菌疑似患者血液的可疑菌株经传统方法鉴定为羊种生物3型布鲁杆菌；经BCSP31-PCR法鉴定为布鲁杆菌属细菌；经牛（A），羊（M）、绵羊附睾（0）和猪（S）种／型AMOS—PCR法鉴定为羊种布鲁杆菌。结论分离自贵州省布鲁杆菌疑似患者血液的菌株确诊为羊种生物3型布鲁杆菌，为贵州省首例人间布鲁杆菌病病例。

2014年贵州省手足口病流行病学特征和肠道病毒71型基因亚型分析

目的 分析贵州省2014年手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）的流行病监测信息报告管理系统中的HFMD资料进行分析。方法 对2014年贵州省HFMD病例的EV-71分离株的VP1编码区进行逆转录-聚合酶链式反应,测定扩增产物的核苷酸序列,使用MEGA（molecular evolutionary genetics analysis,MEGA）6.0软件分析VP1区基因变异特征及基因亲缘关系。结果 2014年贵州省HFMD发病数为50 880例,发病率为145.28/10万,死亡率为0.06/10万。发病高峰在4-6月,其中4月发病数最高,6月死亡数最高,2014年每月贵州省各市均有HFMD报告病例,其中遵义和贵阳发病率较高,散居儿童发病率最高,发病年龄主要在0-5岁幼童,发病率为93.81%,发病数男女之比为1.59∶1。实验室确诊HFMD共计3 877例,占总病例数比例为7.62%,其EV-71占实验室确诊病例数的26.41%,CA-16占32.42%,其他EV占40.74%。结论 2014年每月贵州省各市均有HFMD流行,发病高峰在4-6月,以5岁以下散居儿童为主,以EV-71和CA-16共循环为主。2014年在贵州省分离到的EV-71均属于C4基因亚型中C4a进化分支。

三种分子生物学方法诊断手足口病的比较

目的比较三种分子生物学方法检测临床手足口病标本的敏感性、特异性及优缺。方法采用一步法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、巢式PCR和实时RT-PCR(Real-time RT-PCR,RRT-PCR)三种分子生物学方法检测临床手足口病标本,分别计算检测肠道病毒71型(EV71)阳性率差异的显著性。结果住院及重死病例以EV71感染为主,轻症病例以柯萨奇A组16型(CA16)感染为主;一步法RT-PCR检测EV71病原的阳性率与另外两种差异均有显著性,另外两种差异无显著性。结论巢式PCR及实时RT-PCR检测能显著提高检测的敏感性,一步法RT-PCR可以用在病毒株的鉴定及分析中。

人巨细胞病毒感染对围手术期尿路上皮癌患者免疫功能的影响

目的检测围手术期尿路上皮癌患者外周血的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和人类巨细胞病毒(HCMV)IgG和IgM抗体,了解近期HCMV感染对围手术期尿路上皮癌患者细胞免疫功能的影响。方法采集33例经病理检测确诊为尿路上皮癌的患者外周血,流式细胞仪检测外周血CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群比例,血浆ELISA法定性检测HCMV-IgG和HCMV-IgM抗体,根据HCMV-IgM抗体结果将尿路上皮癌患者分为阳性组和阴性组,比较两组患者的T细胞亚群有无差异。结果 33例患者中HCMV-IgG抗体阳性31例;HCMV-IgM抗体阳性7例,阴性26例。HCMV-IgM阳性组和阴性组之间的CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群有着显著的差异(P<0.01)。阳性组患者的CD4+T细胞的百分比显著低于阴性组,并且该组CD4+/CD8+比值亦显著低于阴性组。CD4+/CD8+的比值提示阳性组中有85%(6/7)的患者处于免疫功能低下状态,而相对于阴性组仅有11.5%(3/23)的患者处于免疫功能低下状态,两组间差异有统计学意义(P<0.01)。结论术前检测HCMV-IgM可以很好地预测尿路上皮癌患者的细胞免疫功能,对术后辅助治疗具有指导意义。

转化生长因子-β1以浓度依赖的方式重组人成熟树突状细胞的细胞骨架丝状肌动蛋白

目的:探索转化生长因子β1(tansforming growth factor-β1,TGF-β1)对人成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs)骨架丝状肌动蛋白(filament actin,F-actin)及其部分骨架结合蛋白表达的影响,为深入理解树突状细胞(dendritic cells,DCs)的生物学行为和提高基于DCs的抗肿瘤免疫治疗的临床效率提供线索。方法:不同浓度的TGF-β1处理mDCs后,用激光共聚焦显微镜和免疫印迹实验分别研究细胞骨架F-actin的结构和部分细胞骨架结合蛋白表达水平的变化。结果:(1)与对照组相比,TGF-β1处理后的mDCs的F-actin出现了明显重排,F-actin的表达量在3 ng/ml组下调(P=0.000),在5 ng/ml组上调(P=0.000)。(2)mDCs表面丝状突起长度和数量的变化,长度在3 ng/ml和5 ng/ml组较对照组细、短(P=0.001,0.000);数量在1、3 ng/ml和5 ng/ml组较对照组少而稀疏(P=0.000);在7 ng/ml组mDCs表面丝状突起长度和数量的变化均无统计学意义(P=0.114);通过回归分析细胞丝状突起长度和数量与F-actin表达量之间存在非线性相关性(R2分别为0.828和0.746,P=0.000)。(3)细胞骨架蛋白结合蛋白的表达,fascin1在所有实验组中均出现了下调(P=0.001、0.000);p-cofilin1与总cofilin1的表达水平比在1 ng/ml和3 ng/ml组均下调(P=0.000);profilin的表达在1、3 ng/ml和5 ng/ml组均上调(P=0.001、0.001、0.013)。结论:TGF-β1以浓度依赖的方式影响mDCs的细胞骨架F-actin结构及其部分结合蛋白的表达,提示在临床上施行基于DCs的抗肿瘤免疫治疗时,需以适当的方式阻断TGF-β1的信号转导通路,这对进一步深入理解DCs的生物学行为和肿瘤的免疫逃逸机制具有重要意义。

贵州省2016年两起乙型流行性感冒暴发疫情病毒血凝素基因特性分析

目的了解2016年贵州省乙型流行性感冒（流感）暴发疫情毒株变异情况，比较其与WHO推荐的疫苗株和我国代表株的匹配情况。方法将2016年贵州省铜仁地区两起流感暴发疫情病例标本中分离得到的8株毒株血凝素（HA）1基因进行扩增和序列测定，通过DNAStar等生物信息学软件对测序产物进行分析。结果2016年两起流感暴发疫情均由乙型Victoria系（BV）病毒引起。分离株核苷酸和氨基酸同源性分别是99.8%～100.0%和99.5%～100.0%，仅部分毒株的247位点发生变异；与参考株B/Victoria/2/87相比，同源性分别是91.8%～92.0%和91.5%～92.0%，有17处氨基酸位点发生了变异，其中I143V、V163I、V201I这3个位点分别涉及到了主要的抗原决定簇的B、C、D三个区域。与既往的疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，同源性分别为98.2%～98.3%和98.5%～99.0%，有3个位点发生变异。所有毒株I143V和N155D均发生变异，部分毒株T247I发生变异，其中I143V涉及到抗原决定簇B区。与我国代表株B/Chongqing-Yuzhong/1384/2010相比，同源性分别是96.7%～96.8%和97.0%～97.5%，有6个位点发生了变异，其中有5个位点分别发生了P84L、I143V、N155D、V172I和T223N的变异，部分毒株T247I发生变异，其中I143V也涉及到B区。与2015年贵州省流行的毒株相比，同源性分别为99.8%～100.0%和99.5%～100.0%，只有部分毒株在位点247发生了变异，且未涉及到主要的抗原决定簇区域。结论贵州省两起流感暴发疫情由BV系同一流行株引起，其HA基因在不断地发生变异，但未出现新的重要位点的变异，与WHO推荐的既往疫苗株B/Brisbane/60/2008匹配性相对较高，继续使用对BV系病毒能起到积极的预防作用。

2017年贵州省H7N9禽流感病毒血凝素基因特性分析

为了解2017年贵州省H7N9禽流感病毒的分子特征和疾病风险,运用生物信息学软件对14株病毒HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关和糖基化位点进行分析,明确了其HA基因核苷酸同源性为95.9%~100%,与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013疫苗株的同源性分别为96.8%~97.8%和96.8%~97.9%;14株毒株均属于长三角分支,来源于5个不同的毒株;其中13株为低致病性禽流感毒株,而A/Guizhou-Weining/CSY01/2017为高致病性禽流感毒株;受体结合关键位点14株毒株均存在G186V的突变,13株存在Q226L的突变;潜在糖基化位点无变异。

贵州省首例人感染高致病性禽流感H7N9突变株血凝素分子特征与溯源分析

目的了解贵州省人感染H7N9禽流感病毒血凝素（hemagglutinin, HA）基因的分子特征、溯源和疾病风险，为高致病性禽流感H7N9病毒的预防和控制提供依据。方法采用实时PCR对5株高致病性禽流感H7N9毒株标本（1株人感染鼻咽拭子标本，4株活禽市场环境标本）进行核酸的提取、HA基因的扩增和测序，运用生物信息学软件对H7N9禽流感病毒HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关位点和糖基化位点变异情况进行分析。结果贵州省威宁县人感染H7N9禽流感病毒HA基因与当地活禽市场环境中H7N9禽流感病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8%和99.6%，而4株活禽市场环境中的H7N9禽流感病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为100.0%和100.0%。与2017年广西人感染的A/Guangxi/5/2017毒株同源性最高，分别为99.7%～99.9%和99.4%～99.8%；与2016年底广东环境中分离的毒株A/Environment/Guangdong/ C16283222/2016同源性为99.0%～99.2%和98.9%～99.2%，而与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013候选疫苗株的同源性为96.8%～97.0%和95.8%～96.2%。与广西毒株A/Guangxi/5/2017遗传进化距离最近。5株毒株HA蛋白裂解位点突变为PEVPKRKRTAR↓GLF，为高致病性禽流感突变株；受体结合关键位点均发生了G186V的突变，均未发生Q226L突变，5株毒株均发生的新突变为A363S，仅感染人的毒株发生的突变是R56K和I297V；5个潜在糖基化位点中仅421NWT和493NNT发生位置后移的变异。结论贵州省威宁县5株H7N9禽流感病毒均为高致病性禽流感突变株，候选疫苗株匹配保护效果可能已经降低，HA蛋白裂解位点、G186V和新的突变位点的变异可能增强了H7N9禽流感病毒对人体的易感性和致病性。

贵阳市2012-2015年B型流行性感冒病毒血凝素基因特性分析

目的了解2012-2015年贵阳市B型流行性感冒(以下简称流感)病毒的变异和流行特点,分析其与WHO推荐的疫苗株和我国的代表株匹配情况。方法将21份标本进行血凝素基因片段1(haemagglutinin 1,HA1)基因序列测定,通过DNA Star version 7.1等软件对测序产物进行分析。结果贵阳市B型流感病毒存在BY和BV两种谱系;核苷酸同源性显示,BV系与疫苗株B/Brisbane/60/2008的同源性为97.8%~99.3%;2013-2014年BY系与疫苗株B/Massachusetts/02/2012的同源性为96.2%~96.5%,与既往的疫苗株B/Wisconsin/01/2010同源性为99.0%~99.3%;2015年BY系与疫苗株B/PHUKET/3073/2013同源性为99.2%~99.5%;2012-2015年BV系与我国代表株B/Chongqing-Yuzhong/1384/2010同源性为96.8%~99.0%,BY系与种子疫苗株B/Hubei-Wujiagang/158/2009为98.2%~99.2%。与当年度疫苗株相比,2013-2014年BY系毒株有9个氨基酸位点发生变异,其中A134P位点涉及到抗原决定簇A区,N142K涉及到B区;2015年BY系毒株发生新的L198Q变异,且涉及到D区;BV系氨基酸位点替换多样,但很少涉及到抗原决定簇。结论 2012-2015年贵阳市人群中B型流感病毒在不断地发生改变,除2013-2014年疫苗株与流行株匹配性不佳以外,其余年度的匹配性均较好,能起到保护作用。