雏鸡体内新城疫病毒强毒的荧光定量RT-PCR检测

将新城疫病毒(NDV)强毒H2株经滴鼻感染和同居感染18日龄雏鸡,应用建立的荧光定量RT-PCR检测病毒在雏鸡体内各组织的动态分布。结果显示,滴鼻感染后第6 h,即可在肺、脑、脾、肾和肠5种组织中检出NDV RNA,而12 h后所有组织均能检测到;同居感染12 h后才可在肺、脑、脾和肾4种组织中检出,而24 h后所有组织均能检测到;在上述2种感染途径中,受检组织内的病毒含量从高到低依次为:肺、脑、脾、肾、肠、肝、心脏和腿肌。与普通RT-PCR相比,检测灵敏度相近。

SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法快速鉴定新城疫病毒毒力

为快速鉴定不同新城疫病毒株（NDV）毒力，我们以NDVF蛋白裂解位点附近的基因序列自行设计1对引物，对不同毒力NDV毒株进行荧光RT—PCR扩增，根据其扩增效率及扩增产物熔解温度（Tm）值大小进行NDV毒株毒力的鉴定，建立了能区分NDV强弱毒株的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法；同时将其与鸡胚平均致死时间（MDT）测定和F蛋白裂解位点序列分析结果进行比较。结果发现：建立的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法只需4h即呵判定结果，NDV强弱毒株扩增产物Tm值为（83±0．5）℃且有2个峰值，阴性对照Tm值为（81±0．5）℃且只有1个峰值；对NDV强毒株的扩增效率即Ct值在11-20之间，NDV弱毒株Ct值在25～30之间，阴性对照Ct值在30以上，Ct值在20～25之问为强弱毒株混合物。该方法检测结果与MDT测定和F蛋白裂解位点分析结果一致。应用SYBRGreenI模式荧光RT—PCR方法与普通RT—PCR方法和鸡胚接种鉴定方法分别对80份临床组织样品进行检测，强毒株的检出率均为53．75％（43／80），而弱毒株的检出率相应为31．25％（25／80）、27．50％（22／80）和35．00％（28／80），检出符合率达89．3％以上。这些结果表明建立的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法具有特异、准确、快速等特点，可用于临床病料样本NDV毒株的毒力鉴定。