免疫筛选恶性疟原虫cDNA克隆

目的 :获取恶性疟原虫 (海南株 )抗原的 c DNA克隆并进行初步鉴定。方法 :采用 dot-EL ISA,以兔免疫血清对恶性疟原虫 c DNA表达文库约 80万个重组噬斑进行筛选 ,并用 2 0株单克隆抗体和恶性疟患者血清对强阳性克隆进行再筛选。 PCR初步鉴定 17个强阳性克隆。结果 :兔免疫血清确定了 17个强阳性克隆 ,患者血清检测到 11个阳性克隆 (含 8个强阳性 ) ,11株单抗与 9个 c DNA克隆呈阳性反应。 17个强阳性克隆均能扩增出大小在 30 0 bp- 2 .5kb左右的条带。结论 :已筛选到能与抗恶性疟原虫兔血清、单克隆抗体及患者血清产生特异性免疫反应的 c DNA克隆。

CD25分子胞外段基因免疫应答中B淋巴细胞的变化及意义

目的用鼠CD25分子胞外段基因疫苗免疫Balb/c小鼠,观察其诱导的体液免疫应答中B淋巴细胞的变化并探讨其意义。方法用pcDNA3.1-CD25胞外段真核表达质粒分别在第0天、第10天和第20天肌肉注射免疫同系Balb/c小鼠,酶联免疫法(ELISA)检测抗CD25胞外段的抗体水平及亚型,FACS检测脾细胞中B淋巴细胞的比例变化及细胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的表达变化。结果与对照组相比,CD25胞外段基因免疫组小鼠血清抗CD25抗体在免疫后逐渐升高,第30天达最高峰;抗CD25抗体主要以IgG1为主;免疫小鼠脾细胞中B细胞的比例变化不显著(P>0.05),但高分泌IL-4和IL-10(P<0.05),而低分泌IFN-γ(P<0.05)。结论 CD25胞外段蛋白基因免疫中B细胞功能变化显著,这为后续深入研究体液免疫应答在T细胞疫苗中的作用提供了前期实验基础。

miRNA-126基因敲减小鼠脾脏中免疫细胞的组成变化

目的:观察miRNA-126基因敲减(Knock down,KD)小鼠脾脏中免疫细胞组成比例变化并探讨其意义。方法:Realtime PCR探针法检测miR-126KD小鼠脾脏中miR-126表达水平,计算脾脏总细胞数;HE染色观察脾脏组织的病理学变化;流式细胞术(FACS)分别检测脾脏中DCs细胞、巨噬细胞、γδT细胞、NKT细胞,CD3^+T细胞和其亚群以及CD19^+B细胞的比例并计算细胞绝对数;免疫印迹法(Western blot,WB)检测脾脏组织中磷酸化NF-κB和磷酸化Akt的表达水平。结果:与野生型(WT)小鼠相比,miR-126KD脾组织中miR-126表达水平明显降低(P<0.05),细胞总数明显增加(P<0.05),且发生明显病理学改变;固有免疫细胞中NK细胞的比例和细胞绝对数显著增加(P<0.05),但巨噬细胞的比例显著降低(P<0.05);适应性免疫细胞中CD3^+T细胞和CD4^+T细胞的比例和绝对细胞数都显著增加(P<0.05),而CD19^+B细胞仅绝对数显著增加(P<0.05);最后miRNA-126KD小鼠脾脏组织的磷酸化NF-κB和磷酸化Akt水平明显增加(P<0.05)。结论:miRNA-126敲减小鼠脾脏中各免疫细胞亚群的组成发生明显改变,可能与NF-κB和Akt信号通路传递变化有关,为后续探讨miR-126在机体免疫应答中的作用提供了前期实验基础。

过表达microRNA-7通过下调CGG结合蛋白1的表达抑制人肺癌细胞生长

目的探讨过表达microRNA-7(miR-7)对人肺癌细胞体内外生长的作用和可能机制。方法利用真核表达载体pcDNA3.1(-)-pri-miR-7(p-miR-7),体外瞬时转染95D人肺癌细胞,MTT法和克隆形成实验检测95D细胞的增殖变化;免疫荧光技术检测95D细胞Ki-67和CGG结合蛋白(CGGBP1)的表达;建立人肺癌裸鼠肿瘤模型,肿瘤局部注射p-miR-7真核表达载体,测量肿瘤大小并观察小鼠生存时间;实时PCR检测肿瘤组织中miR-7表达水平;免疫组织化学技术检测组织中Ki-67和CGGBP1蛋白的表达。结果过表达miR-7可明显抑制肺癌细胞的体外增殖(P<0.05),Ki-67和CGGBP1的表达显著减少(P<0.05);体内实验结果显示,局部注射p-miR-7组中miR-7表达水平明显增加,同时荷瘤裸鼠的肿瘤生长缓慢,生存时间明显延长(P<0.05)。肿瘤组织中Ki-67和CGGBP1蛋白的表达量均显著减少(P<0.05)。结论过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体内外生长,可能与其下调肿瘤生长相关蛋白CGGBP1的表达有关。

miRNA-126真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用

目的:构建miRNA-126的重组真核表达载体,研究其对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖和迁移的影响。方法:设计合成miRNA-126的正义和反义寡核苷酸,构建真核表达载体pcDNA6.2-miR-126,体外瞬时转染至4T1细胞,荧光显微镜下观测转染效率。Real-time PCR检测4T1细胞中miRNA-126的表达,MTT法和克隆形成实验检测4T1细胞的增殖和克隆形成能力,划痕法观察4T1细胞的体外迁移。结果:成功构建pcDNA6.2-miR-126真核表达载体,其可在4T1细胞中有效表达miR-126。与转染空质粒组(pcDNA6.2-Ctrl)相比,瞬时转染72 h后,pcDNA6.2-miR-126转染组4T1细胞的体外增殖能力受到明显抑制[(0.30±0.03)vs(0.51±0.04),P<0.05];瞬时转染48 h后,pcDNA6.2-miR-126组4T1细胞迁移能力也受到明显抑制[(8.17±2.30)vs(28.33±2.16)个,P<0.05]。结论:miRNA-126过表达可抑制乳腺癌4T1细胞的增殖及迁移。

重型乙型肝炎患者血清IP-10的动态观察及临床意义

目的:探讨干扰素诱导蛋白10(IP-10)与重型乙型肝炎(SHB)患者肝脏炎症程度及病情发展的关系.方法:采集SHB患者40例血浆置换(PE)开始、结束及PE后5d血清,根据SHB患者PE后5d病情转归情况分为好转组及恶化组;采集慢性乙型肝炎(CHB)患者及健康对照各20例血清;双抗体夹心ELISA法检测血清干扰素(IFN)诱导蛋白10(IP-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平.常规检测SHB患者入院时、PE后5d总胆红素(TB),凝血酶原活动度(PTA).结果:入院时SHB及CHB组血清IP-10均高于健康对照组(683.56±174.63,216.13±102.92 vs 107.61±55.81,P<0.01),SHB组高于CHB组(P<0.01);SHB患者血清IP-10与TNF-α呈正相关(r=0.366;P<0.05),与PTA呈负相关(r= -0.401;P<0.05),与TB相关性不明显(r=0.223,P>0.05).PE后5d SHB好转组及恶化组较入院时血清IP-10均明显下降(P<0.01,P<0.05),恶化组高于好转组(P<0.01).结论:血清IP-10参与了SHB肝脏的免疫损伤;IP-10水平与肝脏炎症损害程度有关;动态观察IP-10在SHB患者PE前后的变化,能反映SHB患者病情发展及转归.

TTF-1启动子调控miR-7表达对人肺癌95D细胞体外凋亡的影响

目的观察甲状腺转录因子-1(TTF-1)启动子调控miR-7表达对人肺癌细胞体外凋亡的影响,并探讨其意义。方法将前期构建的TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体(命名为p-T-miR-7)与对照载体p-cont分别体外瞬时转染人肺癌95D细胞,采用FCM法检测95D细胞凋亡比例;TUNEL法检测95D细胞凋亡情况;Western blot检测各组中磷酸化Caspase3和磷酸化Caspase9的蛋白的表达;共聚焦显微技术检测miR-7靶分子CGGBP1和EGFR蛋白的表达;最后,采用Western blot检测各组中磷酸化Akt和Erk蛋白的表达。结果体外转染48h后,与p-cont转染组相比,转染p-T-miR-7组细胞凋亡比例明显增加(P<0.05);磷酸化Caspase3和磷酸化Caspase9蛋白水平均显著增加(P<0.05),同时EGFR和CGGBP1蛋白表达均明显降低,且细胞中磷酸化Akt和Erk蛋白水平亦显著降低(P<0.05)。结论 TTF-1启动子调控miR-7表达可导致人肺癌细胞的凋亡。这为后续基于miR-7的人肺癌基因靶向治疗策略的开发提供了前期实验依据。

肿瘤局部湿热治疗乳腺癌实验动物模型的建立及意义

目的:探讨局部湿热治疗对肿瘤生长的影响及意义。方法:建立Balb/c乳腺癌4T1实验动物模型,并以不同温度和作用时间对肿瘤进行局部湿热处理。结果:结果发现43℃作用35min,每周1次,局部湿热治疗可有效控制肿瘤生长,减少肺转移的发生。结论:局部湿热治疗可以有效抑制肿瘤生长,具有潜在的临床推广应用价值。

乳腺癌患者CD4^+CD25^(high)CCR6^+调节性T细胞的变化

目的检测临床乳腺癌患者肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和外周血单个核细胞(PBMCs)中CD4+CD25highCCR6+调节性T细胞的变化,并探讨其意义。方法分离22例乳腺癌患者PBMCs和TILs,用流式细胞仪检测CD4+CD25highCCR6+调节性T细胞的比例,同时检测其Foxp3的表达;进一步用流式细胞仪检测CD4+CD25highCCR6+调节性T细胞记忆分子CD45RO、CD44和CD62L的表达水平;用3H-TdR增殖实验观察CD4+CD25highCCR6+调节性T细胞对CD4+CD25-T细胞增殖的抑制作用。结果乳腺癌患者PBMCs和TILs中CD4+CD25highCCR6+调节性T细胞的比例明显增加,并在肿瘤局部存在显著的富集;CD4+CD25highCCR6+调节性T细胞高表达Foxp3,在体外能有效抑制CD4+CD25-T细胞的增殖,并高表达记忆分子CD45RO、CD44,低表达CD62L,显示了效应/记忆样表型。结论 CD4+CD25highCCR6+调节性T细胞在乳腺癌患者肿瘤局部有明显富集,这可能是肿瘤长期免疫逃逸的重要原因。

小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法从BALB/c小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法获得CD25分子胞外段序列;将其亚克隆入原核表达载体PET-32a,构建好PET-32a-CD25胞外段,并进行酶切及测序鉴定;将PET-32a-CD25胞外段转染大肠杆菌BL21进行表达,并对表达产物进行纯化和鉴定。结果RT-PCR扩增出708 bp的CD25胞外段的基因片段;pET32a-CD25胞外段/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为47×103,重组蛋白用镍树脂纯化后经Western blot检测显示具有良好的免疫反应性,并且可以在体外有效刺激自体T细胞疫苗免疫小鼠脾细胞的增殖并高分泌IL-4。结论CD25胞外段蛋白在原核细胞中成功表达,纯化后的蛋白保持良好的免疫反应性。

结核性胸膜炎患者外周血及胸腔积液中CD4^+和CD8^+ T细胞的活化分析

结核性胸膜炎的发病机制目前仍不清楚。研究表明,免疫缺陷是结核性胸膜炎的重要发病因素。本研究主要通过检测结核性胸膜炎患者外周血和胸腔积液中CD4+和CD8+T细胞的比例变化及其活化程度,分析并探讨结核性胸膜炎患者机体免疫状况。在筛选病例后收集患者的外周血和胸腔积液,分离出单核细胞,采用流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞的比例以及人白细胞抗原DR(HLA-DR)表面活化标记和颗粒酶B在CD8+T细胞中的表达水平。结果显示,结核性胸膜炎患者外周血中CD3+、CD4+和CD8+T细胞的比例均低于健康对照组。患者胸腔积液中CD3+和CD4+T细胞的比例均显著高于外周血,而CD8+T细胞无显著差异。患者外周血中CD4+HLA+和CD8+HLA+T细胞显著高于健康对照组,而CD8+颗粒酶B+T细胞显著低于健康对照组。患者胸腔积液中CD4+HLA+、CD8+HLA+和CD8+颗粒酶B+T细胞均显著低于外周血,仅外周血中CD8+T细胞比例与颗粒酶B水平呈正相关。以上结果表明,结核性胸膜炎患者外周血与胸腔积液中的免疫应答存在差异,提示患者可能存在免疫缺陷。

诱导性CD4^+ CD25^+调节性T细胞的研究进展

诱导性CD4+CD25+调节性T细胞(iTreg)是调节性T细胞的一个重要亚群,在维持机体免疫稳态和免疫相关疾病的发生发展中起重要作用。本文综述了iTreg的分子标记、外周诱导、稳定性以及与疾病的关系等相关方面的研究进展。

空肠弯曲菌外膜蛋白抗血清的制备及其对肠道病原菌鉴别的初步应用

目的：探讨空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，CJ）28KD-31KD外膜蛋白兔抗血清的制备及其对常见肠道病原菌的检测的菌属特异性。方法：采用CJ活菌静脉注射、CJ28KD-31KD蛋白多次、多点皮下注射分别免疫新西兰种大白兔制备抗血清，Western—blotting法鉴定抗血清的抗原性。纯培养的痢疾志贺氏茸、甲型副伤寒沙门氏菌、肖氏沙门菌，希氏沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、变形杆菌、空肠弯曲茸（CF-1）（茼浓度1X109CFU／m1）等常见的肠道病原菌，分别与不同稀释倍数的CJ活菌抗血清和CJ28KD-31KD外膜蛋白抗血清进行常规的直接凝集反应（试管法），观察抗血清对各种已知肠遣病原菌的属的特异性。结果：制备了cJ28KD-31KD外膜蛋白的兔抗血清，CJ活菌抗血清能够与全部CJ甘氨酸提取物发生免疫反应，CJ28KD--31KD外膜蛋白抗血清仅与28KD-31KD外膜蛋白发生反应。CJ活菌抗血清能够与常见肠道病原体发生凝集反应，而CJ28KD-31KD蛋白抗血清仅与空肠弯曲菌（CF—1）发生凝集反应。结论：CJ28KD-31KD外膜蛋白兔抗血清被成功制备，该类蛋白或其中的某些重要组分可能是一种重要的CJ区别其他肠道病原菌的重要目标成分。该类蛋白成分的抗血清的成功制备，将为CJ的诊断血清建立，以及CJ亚单位、基因工程疫苗的研制提供初步的实验依据。

microRNA-7基因敲减对小鼠CD4^+SP细胞胸腺发育的影响

目的:研究microRNA-7(miRNA-7,miR-7)基因敲减对小鼠CD4+SP细胞胸腺发育的影响。方法:检测miR-7基因敲减(miR-7 knock down,miR-7KD)和野生型(Wild-type,WT)小鼠胸腺重量及细胞总数变化;HE染色观察miR-7KD小鼠胸腺的形态学结构改变;FACS检测胸腺CD4+单阳性(Single positive,SP)细胞的比例并计算细胞总数,同时检测CD4+SP细胞CD44及CD62L表达变化;核抗原Ki-67染色法检测CD4+SP细胞的增殖情况;FACS检测CD4+SP细胞的凋亡变化;Western blot技术检测胸腺中总ERK1/2和磷酸化ERK1/2表达水平变化。结果:与WT小鼠相比,miR-7KD小鼠胸腺体积、重量以及细胞总数均显著减少,且形态学结构发生改变(P<0.05);FACS结果显示,miR-7KD小鼠胸腺CD4+SP细胞比例明显降低,且细胞总数减少(P<0.05)。此外,CD4+SP细胞的CD44表达水平显著增加,而CD62L表达水平明显减少(P<0.05);同时,CD4+SP细胞增殖及凋亡比例均显著增加(P<0.01);最后,miR-7KD小鼠胸腺中ERK1/2以及磷酸化ERK1/2的表达均明显下调(P<0.05)。结论:miR-7基因敲减后可显著影响CD4+SP细胞的胸腺发育,这可能与细胞活化水平及ERK1/2信号通路改变有关。

微小RNA-7对人肺癌95D细胞体外增殖的作用

目的:探讨微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)对人肺癌95D细胞体外增殖的作用。方法:采用体外转染法将miR-7瞬时转染95D细胞后,应用Real-time PCR特异探针法检测95D细胞中miR-7的表达情况,应用MTT法检测95D细胞的生长情况,FCM法分析细胞周期变化,并用Western印迹法检测95D细胞中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达的变化。结果:与对照组相比,miR-7转染组95D细胞的miR-7表达水平显著增加(P<0.05),细胞生长明显受抑(P<0.05),且主要阻滞在G1期(P<0.05),而EGFR表达显著下调。结论:miR-7可以抑制人肺癌95D细胞的体外增殖,可能作为后续肺癌生物治疗的新靶点。

体内和体外两种方法制备甲型副伤寒特异性转移因子

目的比较体内、体外两种方法制备的甲型副伤寒特异性转移因子的理化性质及特异免疫活性。方法采用体内、体外两种方法制备甲型副伤寒特异性转移因子,检测其理化性质及以攻击试验测定特异免疫活性。结果两种方法制备的甲型副伤寒特异性转移因子理化性质及特异免疫活性无统计学差异,均符合中国药典生物制品标准。结论制备的甲型副伤寒特异性转移因子具有抗原特异性,能够转移针对甲型副伤寒沙门菌的特异免疫效应。体外法是制备特异转移因子的一种更为简便、经济、有效的方法。