腺苷脱氨酶、C型凝集素及丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在白纹伊蚊唾液腺中的表达

目的了解腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)基因、C型凝集素(C-lectin)基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin)基因在白纹伊蚊唾液腺中的表达情况。方法分别制备未吸血雌蚊唾液腺(SG组)和吸血雌蚊唾液腺(BSG组)、雌蚊躯体(无头无唾液腺,C组)和雄蚊组织(无头含唾液腺,M组)的总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR技术,以β肌动蛋白(β-actin)基因作为内参,根据GenBank公布的ADA、C-lectin和Serpin基因序列设计特异性引物进行RT-PCR,分析以上基因在不同组织中的表达情况。结果与雌蚊躯体和雄蚊组织中相对表达量相比,ADA基因在雌蚊唾液腺中的表达分别提高了545倍和123倍(P<0.01);C-lectin基因在雌蚊唾液腺中的表达分别提高了3929倍和4973倍(P<0.01);Serpin基因在雌蚊唾液腺中的表达分别提高了1911倍和2978倍(P<0.01)。吸血前后雌蚊唾液腺中ADA、C-lectin和Serpin等3个基因的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ADA在蚊虫组织中均有表达,在雌蚊唾液腺中高表达;C-lectin和serpin基因在雌蚊唾液腺中特异高表达。

家蝇幼虫消化器官中纤维素酶的组成及酶活性分析

采用DNSA法研究家蝇3龄幼虫各消化器官中纤维素酶的组成及特性。结果表明,家蝇各消化器官均含有内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4 glucanase,EC 3.2.1.4,EG)、外切β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase,EC3.2.1.91,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21,BG)。家蝇消化器官中EG、CBH和BG的最适反应时间均为60min,最适反应温度为50℃,这些酶在体外的热稳定性较好,在50℃以下处理1h能保持较高的活性。这三种纤维素酶在不同消化器官中的配比关系和活性表现存在一定的差异,其中中肠的酶活性最高,在最适反应条件下,EG、CBH和BG的酶活性分别达到1.02±0.033IU/mg、1.57±0.070IU/mg和1.2±0.048IU/mg。

家蝇取食粗纤维后β-葡萄糖苷酶活性与基因表达量的变化

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)是昆虫降解纤维素起关键作用的限速酶,在糖原降解和糖类代谢方面具有重要的生理功能。本研究用粗纤维含量不同的饲料饲养家蝇Musca domestica,分为对照组(粗纤维含量为30%)、实验组1(粗纤维含量为40%)和实验组2(粗纤维含量为50%)。分别在家蝇发育的不同时期取样,采用实时荧光定量PCR技术和DNSA法检测β-葡萄糖苷酶基因的mRNA表达水平和β-葡萄糖苷酶活性。结果显示,β-葡萄糖苷酶基因mRNA表达水平和酶活性随家蝇的个体发育逐渐提高(P<0.05),并且与饲料中粗纤维的含量呈正相关(P<0.05)。实验组1β-葡萄糖苷酶基因mRNA表达水平较对照组提高了1.7～2.4倍,酶活性提高了1.04～1.37倍;实验组2mRNA表达水平较对照组提高了3.1～5.0倍,酶活性提高了1.19～2.25倍。这些结果表明取食粗纤维对家蝇β-葡萄糖苷酶基因表达量及酶活性具有诱导作用。

白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法。方法根据GenBank上白纹伊蚊β-actin基因的序列（GenBank accession number：DQ657949）,利用Primer Express3.0软件设计并合成一对引物,采用SYBRGreen I作为染料建立实时荧光定量RT-PCR法。以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,并进行溶解曲线分析。结果标准曲线Ct值检测范围为15~30,扩增效率为97.9%,相关系数为0.996,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为86.4℃。结论成功建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法,为β-actin基因作为内参基因进行白纹伊蚊功能基因表达差异研究奠定基础。

中国西部地区牛带绦虫的分子鉴定和生物行为研究进展

本文对近年来涉及中国西部7省(区)10县(市)的牛带绦虫病的流行病学调查和驱虫治疗、成虫标本的形态学观察、11个地理虫株的分子生物学鉴定、牛带绦虫和亚洲带绦虫感染中间宿主猪和牛后囊尾蚴的发育和生物行为观察,以及中间宿主组织病理学变化的比较等进行综述,认为将亚洲带绦虫定为新物种比作为牛带绦虫的亚种更合适。

1株asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌作为核酸疫苗载体的构建与鉴定(英文)

目的利用载体-宿主平衡致死系统,将1株香港分离的野生型沙门氏菌(S129)构建为减毒核酸疫苗载体。方法以细菌生化反应和血清学方法鉴定S129为鼠伤寒沙门氏菌;以λ-RED同源重组方法靶向敲除S129株的asdA基因,并以卡那霉素抗性基因代替;通过菌落PCR鉴定后挑取阳性克隆asdA缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌(asdAΔS129),在含2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid,DAP)或无DAP的LB培养基中培养,与野生株S129对比生长曲线以验证asdAΔS129构建的成功;以S129和asdAΔS129攻击BALB/c小鼠验证asdAΔS129减毒情况;结果菌落PCR鉴定得到阳性克隆,asdAΔS129必需外源性添加DAP方能生长;asdAΔS129不能致死BALB/c小鼠,得到成功的减毒;结论成功将1株野生型沙门氏菌构建成asdA缺陷型减毒核酸疫苗载体,并在体外和体内实验中验证,为下一步的疫苗呈递和肿瘤治疗实验提供了合适的载体。

贵州省黑斑蛙体内裂头蚴扫描电镜观察

自野生黑斑蛙体内检获的裂头蚴,选择5条完整、活动度好的虫体,用戊二醛-锇酸双重固定,经乙醇梯度脱水、真空冷冻干燥、喷金后,用扫描电镜观察并拍照。结果发现,虫体前后两端略膨大,不分节,但表面有不规则环形皱褶;体前端无吸槽,顶端中央有一横向凹陷,凹陷周围体壁呈唇状突起;体后端形态类似前端,但中央为一裂隙,裂隙较前端的凹陷浅、窄;体表的质膜内陷形成大小不等的凹窝和沟纹;整个虫体体表密布尖棘状长短不一的微毛。

谷胱甘肽S-转移酶和乳酸脱氢酶在亚洲带绦虫囊尾蚴中的表达

为开发相关疫苗和治疗靶分子,应用免疫组化、双向电泳（2-DE）结合蛋白质印迹（Western-blotting）技术对亚洲带绦虫囊尾蚴谷胱甘肽S-转移酶（GST）和乳酸脱氢酶（LDH）的表达进行了研究。结果表明：亚洲带绦虫囊尾蚴表达GST,囊尾蚴的双向电泳凝胶共检测到204±11个蛋白质斑点,相对分子质量为Mr14 400~94 000,等电点（pI）为3.0~10.0;Western-blotting分析显示,GST和LDH特异性抗原抗体阳性杂交斑点均为1个,阴性对照均未见阳性杂交斑点;将Western-blotting检测的抗原抗体阳性杂交斑点与原双向电泳凝胶斑点进行比对,均找到对应蛋白斑点,经ImageMaster 2D Platinum 6.0软件分析后初步确定,该蛋白斑点的pI/Mr分别为6.5/25 588和8.2/35 318,与亚洲带绦虫GST和LDH的pI/Mr理论推导值接近。亚洲带绦虫囊尾蚴表达GST和LDH。

未成熟与成熟猪囊尾蚴蛋白双向电泳的图谱分析

为从蛋白质水平揭示猪带绦虫入侵中间宿主家猪的免疫逃避机制,应用双向电泳技术分析未成熟与成熟猪囊尾蚴蛋白质表达差异,进行双向电泳图像软件分析。结果表明:未成熟猪囊尾蚴与成熟猪囊尾蚴蛋白的双向电泳凝胶上分别有(217±13)个、(241±17)个蛋白斑点,未成熟猪囊尾蚴表达上调2倍以上的蛋白有6个,下调2倍以上的蛋白有2个。

黑斑蛙体内裂头蚴组织结构观察

目的:观察黑斑蛙体内裂头蚴的正常组织结构。方法:裂头蚴检获于野生黑斑蛙,将裂头蚴制成常规的组织切片后行HE染色,镜下观察其组织结构,并采集图像。结果:裂头蚴呈白色,长带形,头尾两端有轻度膨大;虫体不分节,但有不规则横皱褶,虫体的顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状,并向后延长一定距离后形成盲端;组织结构为实体,无体腔,有特征性体壁,体壁由皮层和皮下层组成;微毛位于皮层的外表面,遍布整个虫体;皮下层以网状纤维样间质为基质,起支架作用,内有环形和纵行的肌纤维、组织细胞、排泄管和圆形或椭圆形的石灰小体。结论:裂头蚴组织结构的观察为裂头蚴病的病原学诊断及其他裂头蚴的相关研究奠定了基础。

致倦库蚊幼虫中枢神经系统的乙酰胆碱酯酶定位观察

目的:观察致倦库蚊幼虫中枢神经系统结构。方法:用硫代胆碱整体染色法定位乙酰胆碱酯酶。结果:致倦库蚊幼虫中枢神经系统是由脑和位于消化道腹面的腹神经索构成。脑较发达,包括前脑、中脑和后脑;腹神经索包括食道下神经节,3对胸神经节和8对腹神经节。结论:乙酰胆碱酯酶组化定位法可清楚显示致倦库蚊幼虫的神经系统结构。

实验小鼠体内曼氏裂头蚴移行途径及分布的研究

从王锦蛇Elaphe carinate体内检取曼氏裂头蚴Spirometra mansoni,口服法以5条/只感染昆明小鼠,于感染后10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h、7 d、14 d分别处死一组小鼠(3只小鼠/组),观察裂头蚴在小鼠体内的移行及分布。发现小鼠经口服感染裂头蚴后,裂头蚴最早于10 min穿透胃肠壁;感染后20 min,腹腔内已见穿过肠壁的裂头蚴;感染后10 min至6 h,裂头蚴主要见于胃肠腔、胃肠壁和腹腔内;感染24 h,有少数的裂头蚴移行至小鼠皮下;感染7 d后,大多数的裂头蚴移行至皮下组织,从颈部、躯干及头部皮下组织检获的裂头蚴数分别为7条、6条和1条;脑、心脏、肝脏、肾脏及肺等器官未见裂头蚴寄生。小鼠感染曼氏裂头蚴后,裂头蚴经胃肠壁进入腹腔,随后移行至身体的组织器官内寄生,其中以皮下组织多见。

雷丸及吡喹酮对猬迭宫绦虫裂头蚴感染性及超微结构的影响

目的了解雷丸及吡喹酮对猬迭宫绦虫裂头蚴感染性及超微结构的影响。方法从黑斑蛙体内检获裂头蚴,用20、40和80 mg/ml雷丸粉末混悬培养液以及20、80和320μg/ml吡喹酮培养液分别体外培养裂头蚴4、12和24 h,单纯培养液培养4、12和24 h为感染对照组。168只昆明小鼠均分为21组（每组8只）,每组小鼠经口感染相应条件培养后的裂头蚴各5条/鼠。感染后1周剖杀各组小鼠,计数每鼠裂头蚴检出数,并计算每组小鼠的减虫率。扫描电镜和透射电镜分别观察不同培养处理后的裂头蚴超微结构变化。结果小鼠感染经40和80 mg/ml雷丸粉末混悬液分别培养4、12和24 h的裂头蚴1周后,每组小鼠裂头蚴平均检出数分别为1.6、1.0和0.3条,0.3、0和0条,均显著低于对照组（4.1、3.5和3.3条）（P〈0.05）,且两组间差异有统计学意义（P〈0.05）;减虫率分别为60.0%、71.4%和90.1%,92.7%、100%和100%,且两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。小鼠感染经320μg/ml吡喹酮溶液分别培养4、12和24 h的裂头蚴1周后,每组小鼠裂头蚴平均检出数分别为1.9、1.3和0.4条,与对照组间差异均有统计学意义（P〈0.05）;减虫率分别为53.7%、62.9%和87.9%,显著高于20μg/ml吡喹酮处理组的14.6%、2.9%和6.1%以及80μg/ml吡喹酮处理组的24.4%、17.1%和24.2%（P〈0.05）。扫描电镜和透射电镜观察可见,经40 mg/ml雷丸粉末混悬液培养4 h以及320μg/ml吡喹酮溶液培养4和12 h后,裂头蚴虫体出现轻度挛缩;经40 mg/ml雷丸粉末混悬液培养12和24 h,虫体微毛凝集、融合或脱落,质膜破裂,石灰小体释出,皮质组织受损;经80 mg/ml雷丸粉末混悬液培养4-12 h,虫体损害逐渐加重,至24 h,裂头蚴组织结构严重受损,无法辨清;经320μg/ml吡喹酮溶液培养24 h,虫体前端挛缩明显,质膜水肿、泡状隆起,石灰小体形态改变,糖原颗粒耗损,分泌颗粒增加及焰细胞核质浓缩。经20 mg/ml雷丸粉末混悬液、20和80μg/ml吡喹酮溶液培养4、12和24 h的裂头蚴虫体与对照组相比,超微结构无明显改变。结论随着吡喹酮和雷丸体外培养浓度的增加以及时间的延长,裂头蚴对小鼠的感染性逐渐降低,并引起虫体广泛的组织结构损伤;雷丸的作用较吡喹酮明显。

贵州省茂兰国家自然保护区日落前后蚊蠓种群动态的初步观察

目的观察日落前后蚊、蠓种群动态。方法采用网捕法,按一定线路,不同高度,于日落前后进行定时采集。结果采集到的蠓数量最多,有7属1039只,以库蠓属为主;蚊虫为2属2种,共计53只。活动高峰多在日落后1h。结论初步了解翁昂乡民居附近日落前后蚊、蠓的种类组成和动态分布。

感染犬弓首线虫SD大鼠血清IL-6和IL-8含量的变化

目的通过检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)的含量,在免疫分子水平上探讨大鼠感染犬弓首线虫后免疫功能的变化。方法将80只大鼠随机分为两组,每组40只,实验组每只大鼠灌胃犬弓首线虫感染期虫卵约3 000个(对照组大鼠灌胃生理盐水)。分别于大鼠感染犬弓首线虫后第1、2、3、4、5周随机取实验组和对照组大鼠各8只,常规股动脉取血,分离血清,用放射免疫法测定IL-6、IL-8含量。结果①实验组IL-6含量在第1、2、3、4、5周均高于对照组(P<0.05或P<0.01),第2周达最高值,之后下降;②实验组IL-8含量在第1、2、3、5周高于对照组(P<0.05或P<0.01),第4周与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 SD大鼠感染犬弓首线虫后血清IL-6含量升高,提示IL-6与抗虫作用有关,但随着时间的推移,这种保护作用逐渐减弱;感染鼠血清趋化性细胞因子IL-8含量升高,且观察期内含量变化不大,提示非特异性免疫功能增强,且在移行期非特异性免疫功能无显著变化。

亚洲带绦虫囊尾蚴特异性抗原筛选和鉴定

目的对亚洲带绦虫囊尾蚴的特异性抗原进行筛选、鉴定和生物信息学分析。方法 6头20 d龄三元杂交乳猪随机分为实验组和对照组,实验组每头灌胃亚洲带绦虫虫卵悬液8.4万个;20 d后,分别制备实验组及对照组心脏血混合血清;收集、制备实验组亚洲带绦虫囊尾蚴蛋白并进行双向电泳分析,将凝胶蛋白斑点转移至聚偏氟乙烯膜,用实验组及对照组混合血清(均为1∶10)为一抗,羊抗猪辣根过氧化物酶-IgG(1∶200)为二抗,进行蛋白质印迹分析和质谱鉴定。结果双向电泳凝胶共检测到(204±11)个蛋白质斑点,相对分子质量为14 400～94 000 kPa,等电点(pI)为3.0～10.0;筛选出6个特异性抗原,经质谱鉴定出其中2个蛋白,分别为ATP酶管家基因3-类蛋白2(AT-Pase family gene 3-like protein 2)和ATP合成酶β亚基(ATP synthase beta subunit),均与美国国家生物技术信息中心(NCBI)网上登录的亚洲带绦虫成虫蛋白一致,确定为亚洲带绦虫囊尾蚴特异性抗原。结论获得2个亚洲带绦虫囊尾蚴特异性抗原,其免疫原性有待进一步研究,以便为研制抗囊尾蚴病疫苗提供参考。