猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析

目的利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆表达和免疫学特性研究。方法利用NCBI和ExPASy中有关基因、蛋白的序列和结构信息分析工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶A(TsLDH-A)的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白的结构与功能;并将TsLDH-A克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中诱导表达,表达产物经纯化后用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果该基因全长1 332bp,编码331个氨基酸。其氨基酸序列与其它物种LDH-A氨基酸序列一致性可达54%,具有乳酸脱氢酶保守结构域。其编码的蛋白理论分子量为3 5461.1Da,有3个跨膜区和多个磷酸化位点,蛋白的理化性质较稳定。预测有4个主要的B细胞抗原表位,L-乳酸脱氢酶活化位点之一的His192包含于表位190-199aa中。酶催化位点的3个关键氨基酸在空间结构上相互靠近。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-TsLDH-A构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白能被TsLDH-A重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染了猪带绦虫的病人血清及猪血清识别,表明其具有较好的免疫原性和免疫反应性。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TsLDH-A的全长序列并预测得到其编码蛋白的结构与功能方面的信息,该基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达。

猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的原核表达及免疫学研究

目的通过对猪带绦虫谷胱甘肽转移酶GST的表达,对其免疫性进行初步研究。方法利用生物信息学从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出谷胱甘肽转移酶(GST)基因,将其克隆到原核表达载体pET28a(+),经过双酶切、PCR鉴定后,异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析,Western blotting鉴定该蛋白免疫反应性。结果成功构建了重组体,并得到高纯度蛋白,该蛋白可被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫谷胱甘肽转移酶可在原核系统中获得具有免疫反应性的高效表达。

生物信息学分析亚洲牛带绦虫乳酸脱氢酶基因及其蛋白的结构与特性

目的分析和预测亚洲牛带绦虫(Taeniasaginata asiatica,Ta)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因及其编码蛋白的结构和特性,以指导其生物学功能的实验研究。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心(NC-BI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://ca.expasy.org/)中有关基因和蛋白序列、结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,如DNAman和Vector NTI suite,从亚洲牛带绦虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶(TaLDH)基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、抗原表位、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象,酶的活性中心在拓扑结构和空间构象中的位置分布等。结果该基因全长1285bp,编码区为92bp-1084bp,编码331个氨基酸,其推导氨基酸序列与其它物种乳酸脱氢酶氨基酸序列一致性达50%左右,具有乳酸脱氢酶保守结构域。其编码的蛋白相对分子量理论预测值和等电点分别是35268.9Da和8.03。其编码的蛋白有3个跨膜区、没有其它亚细胞定位序列。α螺旋(H)、β折叠(E)和无规卷曲(L)的比例分别是36.56:22.96:40.48,L-乳酸脱氢酶活化位点,位于189-195aa,TaLDH氨基酸序列中有16个潜在抗原表位,酶催化位点的关键氨基酸在不同物种中保守,在空间结构中3个关键氨基酸相互靠近。结论应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TaLDH的cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息。

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其蛋白质结构与功能的生物信息学分析

目的分析和预测亚洲牛带绦虫泛素缀合酶基因及其编码蛋白的结构与功能特性,用于指导其生物学功能的实验研究。方法利用美国国家生物技术信息中心和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其它生物信息学分析软件包,如VectorNTIsuite,从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中识别出泛素缀合酶基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构等。结果该序列为全长基因,编码区为76bp-537bp,编码154个氨基酸。该序列为泛素缀合酶基因同源序列。其编码蛋白的理论分子量为17397.1,亚细胞定位在细胞核。预测该蛋白无跨膜区。与吸虫属的泛素缀合酶进化关系最近。结论应用生物信息方法从亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了亚洲牛带绦虫泛素缀合酶cDNA全长序列并预测得到其结构与功能方面的信息。

亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学分析

目的对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor1,EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-EF-1构建成功。重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别,表明其具有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

猪带绦虫腺苷酸激酶的克隆及其重组蛋白免疫反应性的评价

为原核表达猪带绦虫腺苷酸激酶(ADK),对其免疫性进行初步研究,本研究以猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中ADK同源基因重组质粒为模板,通过PCR扩增并将其亚克隆于原核表达载体pET28a(+),构建了pET-Ts-ADK重组质粒,经IPTG诱导表达,并通过SDS-PAGE鉴定,表明重组蛋白约30ku。经His-镍蛋白纯化柱纯化后western blot试验表明该重组蛋白可被猪带绦虫、亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明猪带绦虫ADK基因在原核表达系统中表达获得的蛋白具有免疫反应性。

亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2的克隆表达及免疫鉴定

目的克隆表达亚洲牛带绦虫泛素缀合酶E2(UBCE2)全长编码序列,获得纯化的重组蛋白,为进一步功能研究做充分准备。方法以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中含有UBCE2基因的质粒作为模板,扩增该基因,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,测序鉴定重组质粒,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,并使用Western blotting分析其免疫反应性。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-UBCE2构建成功,该基因在大肠杆菌中以包涵体形式得到表达,十二烷基肌氨酸钠纯化后蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果表明该基因在大肠杆菌BL-21/DE3得到高效表达,亲和层析得到高纯度的蛋白且该重组蛋白可被亚洲带绦虫及牛带绦虫患者血清识别,表明其有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫UBCE2可在原核表达系统中表达,并具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能奠定基础。

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因(TaRPL8),探索其应用前景。方法用RT-PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPL8基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPL8基因可在大肠埃希菌BL21/DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。

银杏内酯对拟AD模型大鼠海马CA1区Aβ_(1-40)表达的影响

目的:研究银杏内酯对拟阿尔茨海默病(AD)模型大鼠海马CA1区Aβ1-40表达的影响。方法:采用冈田酸(OA)海马CA1区微量注射建立拟AD大鼠模型,3周后银杏内酯腹腔注射,水迷宫行为学试验检测学习记忆能力,免疫组织化学方法观察海马CA1区Aβ1-40的表达。结果:与拟AD模型组比较,银杏内酯组平均逃避潜伏期明显缩短(P<0.01),银杏内酯组海马CA1区Aβ1-40表达明显减少或消失(P<0.01)。结论:银杏内酯显著改善拟AD模型大鼠学习记忆能力,其机理可能是抑制海马Aβ1-40的表达及tau蛋白磷酸化,减轻OA对大鼠海马神经元的病理损害。

牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及EST测序

目的构建牛带绦虫(Taeniasaginata)成虫全长cDNA质粒文库,为寻找更多有效的牛带绦虫病疫苗候选抗原分子及对三种主要人体带绦虫的功能基因对比研究奠定基础。方法提取牛带绦虫成虫mRNA;进行反转录合成双链cD-NA。PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiI酶切;用CHROMA SPIN-400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并与改造载体pBluescript Ⅱ SK连接,将连接产物涂板,测定文库的滴度;用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建文库质量。随机挑选质粒文库转化的阳性重组克隆,进行较大规模的5′端测序,归并UniGene。结果测定文库的滴度为1016个菌落/μL,共测1023个克隆,对这些序列进行UniGene归并,得到419条unigene。结论已成功获得高质量的牛带绦虫成虫全长cDNA表达文库。

猪带绦虫成虫烯醇酶基因的生物信息学分析

目的分析猪带绦虫成虫烯醇酶（enolase,Ts ENO）基因结构并预测其编码蛋白的结构和功能。方法利用生物信息网站如美国国家生物技术信息中心（NCBI）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY）中生物信息学分析工具,并结合其它分析软件,从获得猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的表达序列标签（expression sequence tag,EST）中识别Ts ENO基因,分析该基因的结构并预测其编码的蛋白质的结构和功能特征。结果该基因与亚洲带绦虫烯醇酶基因的一致性为98%,相似性为99%;全长1 725bp,编码区为202~1162bp,编码320个氨基酸,为全长基因。无各种亚细胞定位序列,预测该蛋白为跨膜蛋白,与吸虫属的进化关系较近。结论从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出烯醇酶基因,预测为跨膜蛋白,可能具有较好的免疫诊断抗原应用前景。

亚洲带绦虫RNA聚合酶亚单位Ⅱ基因的生物信息学分析

目的分析和预测亚洲带绦虫成虫RNA聚合酶亚单位Ⅱ基因及其编码的蛋白的结构和功能。方法利用一系列的生物信息学软件分析了亚洲带绦虫RNA聚合酶亚单位Ⅱ蛋白的氨基酸组成、等电点、亚细胞定位、跨膜区、二级结构等蛋白质性质,并同日本血吸虫、秀丽隐杆线虫、果蝇、人等的蛋白作了对比。结果Blastx分析该基因为全长基因,该基因全长645bp,编码区为45～517,编码157个氨基酸;无跨膜区;具有较稳定的理化性质。结论应用生物信息学方法从亚洲带绦虫成虫cD-NA文库中筛选出聚合酶亚单位Ⅱ基因。

人体带绦虫的分子鉴定

目的:对采自云南大理的6条人体带绦虫进行虫种分子鉴定。方法:对云南省大理有排节片史的病人以槟榔-南瓜子法驱虫,对6条人体带绦虫成虫进行形态学鉴定;提取虫体基因组DNA,用亚洲带绦虫和牛带绦虫线粒体cox1基因片段的特异性引物对DNA进行常规PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测;将虫卵喂食2头幼猪(5×105/头),40 d后解剖检查.观察囊尾蚴寄生情况。结果:6条人体带绦虫的形态和牛带绦虫相似,亚洲带绦虫cox1片段PCR为阳性,扩增产物约260 bp,牛带绦虫cox1片段PCR均为阴性;只在感染幼猪肝脏发现有囊尾蚴寄生,其他组织和肌肉内没有囊尾蚴寄生。结论:形态学和分子生物学鉴定6条人体带绦虫标本均属于亚洲带绦虫。

猪带绦虫CDC37基因及其蛋白结构特征的生物信息学分析

目的:分析和预测猪带绦虫细胞分裂周期蛋白37(Ts CDC37)基因及其编码蛋白的结构和特性,用于指导其生物学功能的实验研究。方法:利用生物信息学网站所提供的有关基因和蛋白序列和结构功能分析工具,以及专业的生物信息学软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别CDC37基因,对猪带绦虫CDC37基因编码的蛋白质进行生物信息学分析。结果:该基因全长1 203 bp,编码400个氨基酸,为全长基因。Genebank中与日本血吸虫的cell division side 37 homolog蛋白的一致性最高,达60%。相对分子量理论预测值为46 802.5 ku,预测其有6个主要的B细胞抗原表位,无亚细胞定位序列。结论:应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了猪带绦虫CDC37基因全长序列并预测得到其结构与功能方面信息。

猪带绦虫成虫凝溶胶蛋白基因的生物信息学分析

目的：分析猪带绦虫（Taenia solium）成虫凝溶胶蛋白（gelsolin,GEL）基因及编码蛋白的结构和功能。方法：利用生物信息网站美国国家生物技术信息中心（NCBI）和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY）中生物信息学分析工具,并结合其它分析软件,从获得的猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的表达序列标签（EST）中识别凝溶胶蛋白基因,分析该基因的结构并预测其编码蛋白质的结构和功能特征。结果：猪带绦虫成虫凝溶胶蛋白基因与细粒棘球绦虫凝溶胶蛋白的一致性为88%,相似性为93%;全长1 514 bp,编码区为167~1 263 bp,编码365个氨基酸,无各种亚细胞定位序列,具有多个潜在的磷酸化位点,蛋白在溶液中性质稳定。结论：应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出了猪带绦虫凝溶胶蛋白cDNA全长序列并预测其结构与功能。

亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学分析

目的对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(Annexins B2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Annexins B2基因,并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化,纯化的重组蛋白用Western blotting进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及重组质粒DNA测序均显示重组体构建成功,并得到高纯度的蛋白,且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别。结论亚洲带绦虫成虫Annexins B2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。

牛带绦虫亚洲亚种核糖体蛋白L10a基因分析

目的：分析和预测牛带绦虫亚洲亚种成虫核糖体蛋白LlOa基因及其编码蛋白的结构和功能。方法：构建牛带绦虫亚洲亚种成虫eDNA文库，进行EST测序，将EST序列与GenBank中登陆的序列进行同源性比对及基因完整性判断；应用NCBI上的BLAST对所筛选基因的保守域进行搜索比对，利用PredictProtein分析、预测其功能域及二级结构。结果：BLASTX分析该基因为全长基因，全长698bp，编码区为24-681，编码218个氨基酸，无跨膜区，具有较稳定的理化性质。结论：从牛带绦虫亚洲亚种成虫cDNA文库中筛选出核糖体蛋白L10a基因。

牛带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶基因的生物信息学分析

目的:分析牛带绦虫成虫谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因结构并预测其编码蛋白的结构和功能。方法:利用生物信息学网站如NCBI和ExPASY系统中的生物信息学分析工具,并结合其它分析软件,分析该基因的结构并预测其编码蛋白质的结构和功能。结果:该基因全长908 bp,编码区为135～771 bp,编码212个氨基酸,无各种亚细胞定位序列;与猪带绦虫GST的一致性为93%,相似性为96%;预测3个主要的抗原表位33～53 aa,62～68 aa,179～184 aa位于空间结构上相距较远的分子表面。结论:从牛带绦虫成虫cDNA文库中筛选出GST基因,预测为胞浆型蛋白,可能具有较好的免疫学诊断抗原应用前景。