家蝇幼虫血淋巴蛋白组及血淋巴中热稳定蛋白研究

目的初步研究家蝇幼虫血淋巴蛋白组学特征及其中的热稳定蛋白。方法使用破壁法提取三龄幼虫血淋巴原液,设置全血淋巴组、沸水浴处理组,采用不同pH范围双向电泳胶条,分析血淋巴中蛋白的pH、分子量分布特点,采用二级质谱对蛋白点进行分子鉴定。结果家蝇幼虫血淋巴中蛋白的分子量主要分布在10kDa～66kDa之间,采用pH3～10的IPG胶,检测到286个蛋白点,采用pH4～7的IPG胶,测到601个蛋白点;血淋巴经沸水浴处理后,检测到41个蛋白点,分子量低于30kDa,比未处理组减少了93.1%,对其中11个蛋白点进行质谱分析,鉴定出4个功能蛋白,包括存储蛋白、气味结合蛋白、铁蛋白重链样蛋白和铁蛋白2轻链蛋白同系物。结论双向电泳能很好地分析家蝇幼虫血淋巴中的蛋白,血淋巴中的蛋白等电点主要分布在pH4～7之间;血淋巴经沸水浴处理后可去掉大量变性蛋白,其上清中可能包含耐热性较好的功能蛋白。

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因(TaRPL8),探索其应用前景。方法用RT-PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPL8基因,克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPL8基因可在大肠埃希菌BL21/DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。

牛带绦虫不同亚种感染家猪后血清IL-2和INF-γ含量的比较

目的通过观察比较牛带绦虫两亚种感染家猪后血清IL-2和INF-γ含量的变化,探讨牛带绦虫不同亚种所致家猪Th1细胞应答机制。方法用亚洲牛带绦虫虫卵和传统牛带绦虫虫卵分别灌胃20d龄健康乳猪各5头,以健康乳猪5头作对照,于感染后第7、15、45和75d抽取猪耳缘静脉血,常规分离血清。用ELISA试剂盒检测血清IL-2和INF-γ含量。结果正常组血清IL-2和INF-γ含量在不同时期基本处于稳定水平;亚洲牛带绦虫组血清IL-2和INF-γ在第7d含量最高,远高于传统牛带绦虫组(P<0.01),15d含量降低,远低于传统牛带绦虫组,两个实验组在第45d和75d无显著差异;与正常组相比,两个实验组血清IL-2和INF-γ含量在第7、15和75d均明显高于正常组(P<0.01)。结论牛带绦虫两个亚种感染家猪后,早期Th1细胞应答较强,中期Th1细胞应答较低,晚期Th1细胞应答增强,但亚洲牛带绦虫所致家猪Th1细胞应答在第7d最强,传统牛带绦虫所致家猪Th1细胞应答在第15d最强。

白纹伊蚊唾液腺serpin1基因的可变剪接分析与原核表达

目的克隆并原核表达白纹伊蚊唾液腺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因1(Aalbserpin-1)。方法根据NCBI网站上白纹伊蚊Aalbserpin-1(AY826096.1)的序列设计引物,用RT-PCR从白纹伊蚊广州株中获取Aalbserpin-1全长基因序列,并进行生物信息学分析。将目的片段克隆到原核表达载体pET28a(+),转化到大肠杆菌中诱导表达。利用实时荧光定量RTPCR分析Aalbserpin-1_2基因在白纹伊蚊不同组织中的表达差异。结果 PCR扩增获得Aalbserpin-1基因两个转录本(Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2),Aalbserpin1_1的基因序列为1 260bp,编码419个氨基酸;Aalbserpin1_2的基因序列为1 332bp,编码443个氨基酸,均具有seprin结构域,Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2与Aalbserpin-1(AY826096.1)相比,相似性分别为95%和90%。两个转录本比较,Aalbserpin1_2中含有24个氨基酸的可变剪接子正好位于其功能活性中心环(RCL)上。以Aalbserpin1_2序列为模板,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒。SDS-PAGE结果显示目的基因在Origami(DE3)中表达,重组蛋白相对分子量(Mr)约为50 000Da,经亲和层析获得目的蛋白。组织表达谱显示Aalbserpin-1_2在唾液腺(SG)、中肠(MG,P>0.05)丰富表达,脂肪体低表达(FB,P<0.05)。结论白纹伊蚊广州株Aalbserpin-1基因具有两个可变剪接子,其中Aalbserpin-1_2在唾液腺、中肠丰富表达,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒并获得重组蛋白。

甲泼尼龙治疗支气管哮喘的临床疗效观察

目的了解甲泼尼龙治疗支气管哮喘急性发作的临床效果。方法将支气管哮喘患者93例随机分为两组,实验组48例,对照组45例;对照组常规静点二羟丙茶碱、吸入β2受体激动剂、输液等治疗,实验组在相同对照组治疗基础上,加用甲强龙80mg/次,2次/d静点。治疗前和治疗第2天、第4天分别观察症状、体征及动脉血PaO2变化。结果治疗前两组患者均为支气管哮喘急性发作,动脉血PaO2平均值比较差异无统计学意义;治疗第2天、第4天,治疗组缓解率分别为79.17%、95.83%,对照组缓解率分别为62.22%、77.78%,两组比较差异有统计学意义;治疗第2天、第4天实验组动脉血PaO2值分别为(79.1±7.4)mmHg、(93.4±4.7)mmHg,对照组动脉血PaO2值分别为(69.5±6.8)mmHg、(87.6±4.3)mmHg,两组比较差异有统计学意义。结论甲泼尼龙治疗支气管哮喘急性发作有效且快速,可快速缓解哮喘症状、缩短住院日期。

白纹伊蚊唾液腺34 ku-2基因克隆与原核表达

目的克隆并表达白纹伊蚊唾液腺Aalb_34ku-2蛋白。方法根据白纹伊蚊(罗马株)34ku-2开放读码框序列(Aalb_34ku-2)(GenBank:AY826118.1)设计特异引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊广州株雌蚊体内扩增获得Aalb_34ku-2基因。利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白序列的分析工具,结合其他生物信息学分析软件包,分析预测该蛋白质的结构功能;将该基因克隆到原核表达质粒pET28a(+)中,重组质粒在大肠埃希菌BL21/DE3中经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定。结果 RT-PCR扩增获得Aalb_34ku-2 2个转录本。Aalb_34ku-2_1序列长度为954bp,编码318个氨基酸,等电点为5.84;Aalb_34ku-2_2的ORF为882bp,编码294个氨基酸,等电点为6.09。两者相差24个氨基酸;构建Pet28a(+)-Aalb_34ku-2_1重组表达载体并转入大肠埃希菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导后得到的重组蛋白与目的蛋白分子质量(34ku)相符,经鉴定为包涵体蛋白。结论成功构建pET28a(+)-Aalb_34ku-2_1重组原核表达质粒并表达出融合蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

儿童重症监护室产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的耐药基因及其流行病学特征

目的 了解贵阳市儿童医院儿科重症监护室（PICU）产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌感染的耐药基因型及其分子流行病学特征.方法 采用纸片扩散法和自动化仪器对临床分离菌株作用药敏试验,ESBLs表型确认试验采用双纸片协同法,采用PCR法检测耐药基因.结果 2013年4月至12月住院患儿分离出44株非重复肺炎克雷伯菌,检出产ESBLs肺炎克雷伯菌共29株,阳性率达65.9％.29株产ESBLs肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类、头霉素类及喹诺酮类高度敏感,对青霉素类和第一、二代头孢菌素类耐药率均为100％;15株非产ESBLs肺炎克雷伯菌株仅对青霉素类耐药率达100％.产ESBLs肺炎克雷伯菌对9种抗生素耐药率（氨苄西林/舒巴坦79.3％、头孢唑啉100.0％、头孢呋辛100.0％、头孢孟多100.0％、头孢曲松100.0％、头孢他啶79.3％、头孢吡肟65.5％、庆大霉素41.4％、氨曲南79.3％）明显高于与非产ESBLs菌株（氨苄西林/舒巴坦13.3％、头孢唑啉6.7％、头孢呋辛20.0％、头孢孟多20.0％、头孢曲松0、头孢他啶0、头孢吡肟0、庆大霉素6.7％、氨曲南0）（x2=17.54、35.51、28.00、28.00、44.00、24.93、17.30、4.18、24.93,P均＜0.05）.29株产ESBLs肺炎克雷伯菌共检出3种ESBLs耐药基因,检出率最高的是SHV型[93.1％（27/29株）],其次是TEM型和CTX-M型,分别占51.7％（15/29株）和37.9％（11/29株）.29株产ESBLs肺炎克雷伯菌基因型分布有5种形式：14株携带单一ESBLs基因,占48.3％;5株同时携带2种基因型,占17.2％;9株携带3种基因型,占31.0％;1株未能分型.结论 产ESBLs肺炎克雷伯菌已在贵阳市儿童医院PICU广泛流行,且具有多重耐药性,其耐药基因型已出现多样化的特征.

猪囊尾蚴抗原基因6H的克隆、表达及鉴定

目的为寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子奠定基础。方法设计合成引物,用PCR法从cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴抗原6H基因编码序列,将其克隆入PMD-18T载体,然后在原核表达载体PET-28a中亚克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot观察表达结果。结果用PCR法扩增出一条大小约774bp的特异性片段,克隆质粒PMD-18T-6H和原核表达质粒PET-28a-6H作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约33kDa大小的融合蛋白条带,Western blot结果显示其可与猪囊尾蚴病人血清起反应。结论本实验成功地克隆了猪囊尾蚴抗原6H编码基因,并在原核细胞中进行了表达及鉴定,为进一步免疫诊断研究奠定了基础。