六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因导入增强外周血单个核细胞抗药性

目的研究六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)基因导入后人外周血单个核细胞(PBMC)对烷化剂抗药性的改变。方法利用脂质体法将含人MGMT基因的真核表达载体导入体外培养的外周血单个核细胞,实时PCR及Western blot检测目的基因mRNA及蛋白水平的表达。四氮唑蓝法(MTT)检测细胞对硝卡芥抗药性的改变。结果转染目的基因组在mRNA及蛋白水平与转空载体及对照相比均为高表达。MTT法结果显示转目的基因组对硝卡芥的IC50是转空载体组及对照组的两倍。结论MGMT基因导入能够增强外周血单个核细胞对烷化剂的抗性从而起到保护作用。

细胞色素氧化酶P450 3A4基因联合环磷酰胺的体外抗肿瘤效应

目的克隆细胞色素氧化酶P4503A4(CYP3A4)基因,构建真核表达质粒并导入K562细胞进行表达,研究CYP3A4联合环磷酰胺(CPA)的体外抗肿瘤效应。方法利用RT-PCR从人肝细胞中克隆CYP3A4基因,构建重组真核表达载体。脂质体法导入K562细胞,RT-PCR和Western blot检测CYP3A4基因在K562细胞中的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。MTT法检测CYP3A4联合CPA对肿瘤细胞的抑制作用。结果成功克隆CYP3A4基因并构建了真核表达质粒pcDNA3.1/myc-HisA(+)-CYP3A4。RT-PCR和Western blot分别显示转基因组的CYP3A4 mRNA和蛋白质表达水平均显著高于转空载体组和对照组。MTT示转基因组IC50值为1.09016mmol/L,明显低于转空载体组和对照组。酶诱导剂和抑制剂分别能够减低和增高转基因组IC50。结论CYP3A4体外具有联合CPA的抗肿瘤作用,这种作用能够被CYP3A4相应的诱导剂和抑制剂增强或减低。

含CYP2E1基因的重组腺病毒载体转染人骨髓间充质干细胞联合达卡巴嗪的抗肿瘤效应

目的 构建含人细胞色素P-450 CYP2E1（CYP2E1）基因的缺陷型重组腺病毒载体,检测其协同化疗药物的抗肿瘤效应,为基因介导酶前药治疗提供新的思路.方法 克隆人肝CYP2E1全长cDNA,制备高滴度的重组腺病毒颗粒（1.2×1012 pfu/ml）.分离、培养、传代纯化及鉴定人骨髓间充质干细胞（BMSC）.用Transwell小室检测BMSC向肿瘤细胞的趋化迁移.将重组腺病毒分别转染BMSC和人黑色素瘤细胞A375细胞.荧光显微镜和RT-PCR、Western印迹法分别检测转基因细胞中外源增强绿色荧光蛋白（EGFP）、CYP2E1的表达.倒置显微镜、四甲基偶氮唑盐（MTT）和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）双染色法检测CYP2E1协同酶前药达卡巴嗪（DTIC）的抗肿瘤效应（实验分A375-CYP2E1组、BMSC-CYP2E1组和BMSC-CYP2E1＋A375组,并以各自空载体组作为对照;细胞接种后分别加入不同浓度DTIC）.结果 成功构建重组腺病毒载体pAd5CMV-NpA-CYP2E1和pAd5CMV-NpA-EGFP.成功分离BMSC,并证明BMSC可通过聚碳酸酯膜分别向下室内的K562和A375细胞迁移.荧光显微镜检测到转基因靶细胞EGFP表达,RT-PCR和Western印迹法均检测到目的基因在转基因细胞中高表达.倒置显微镜下见加入DTIC后BMSCCYP2E1＋A375组的死亡细胞明显多于对照组.MTT法示DTIC呈浓度依赖性抑制转CYP2E1基因的细胞生长,其中BMSC-CYP2E1＋A375组药物半数抑制量（IC50）值为（0.17±0.13）mmol/L,其对照组为（0.65±0.20）mmol/L,二者差异有统计学意义（P＜0.01）,可选0.05 mmol/L DTIC浓度作人BMSC的相对安全浓度.Annexin V/PI法示0.05 mmol/L DTIC处理细胞48 h后BMSC-CYP2E1＋A375组细胞凋亡率明显高于其对照组（26.8±2.0比8.7±1.3,P＜0.01）.结论 BMSC体外具有向肿瘤细胞趋化迁移的特性.重组腺病毒载体介导的CYP2E1转染BMSC具有协同化疗前药的抗肿瘤效应.