骨髓间充质干细胞对大鼠佐剂性关节炎防治的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠佐剂性关节炎(AA)的治疗、干预作用。方法收集培养扩增SD大鼠骨髓MSCs。SD大鼠注射弗氏完全佐剂造模之后行MSCs治疗及干预。造模后定期测量大鼠体质量、踝关节周长和后足爪体积。治疗后第21天,行四肢关节X线片及病理检查。结果模型大鼠经MSCs治疗后关节肿胀减轻,X线片示骨质破坏明显修复。病理HE染色见关节滑膜病变减轻。干预组经MSCs治疗,原发性炎症和继发病变均不明显,关节X线片和病理检查均未见明显异常,与模型组大鼠相比,体质量、足爪体积以及踝关节周长差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MSCs治疗可有效减轻并逆转弗氏完全佐剂诱导的大鼠AA的进展。

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠实验性心肌梗死

目的：研究骨髓间充质干细胞（MMSCs）移植治疗大鼠实验性心肌梗死（MI）远期疗效是否稳定。方法：采用开胸结扎冠状动脉左前降支（LAD）的方法制作MI动物模型,造模成功后12~14 d经舌下静脉移植已转染增强型绿色荧光蛋白（pEGFP-C1）的MMSCs,分4周及8周两时段检测动物的体重变化、血流动力学、组织病理学、微血管密度并用荧光显微镜观察。结果：无论在4周还是8周移植组体重较同期模型组体重显著增加,移植组心率（HR）较同期模型组显著下降。4周时移植组动脉收缩压（SBP）、动脉舒张压（DBP）及平均动脉压（MAP）较模型组无明显改变,8周时则较模型组显著增高。心脏组织病理学改变：4周时移植组较模型组心梗形态学改变减轻,8周时则进一步减轻。荧光显微镜下可见移植组MI边缘区域新生的微血管内皮细胞上有绿色荧光表达;移植组的微血管密度较同期模型组的微血管密度明显增高。结论：MMSCs移植可较为有效地改善大鼠实验性MI后心功能状况,远期疗效也较为稳定。

聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性

背景:聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物是近年来受到重视的聚羟基脂肪酸族组织工程支架材料,具有免疫排斥反应低、生物相容性好和降解产物无毒副作用的优点。目的:观察聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料与人骨髓间充质干细胞的体外生物相容性。方法:将第3代人骨髓间充质干细胞种植于聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上作为实验组,培养板单纯培养细胞作为对照组,计算1,2,4 h两组贴壁细胞的数量,得出细胞贴壁率。MTT比色法观察2,4,6,8 d两组细胞的增殖情况。采用Hoechst33258荧光法,检测3,6,9,12 d两组细胞内的DNA含量。将人骨髓间充质干细胞接种聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料上5 d后,电镜扫描观察细胞在材料上的生长情况。结果与结论:共培养1 h时,实验组的细胞贴壁率低于对照组;其他时间段两组之间细胞贴壁率差异无显著意义。两组各时点间的细胞增殖差异无显著意义。两组各时间点细胞内DNA含量差异无显著意义。扫描电镜观察人骨髓间充质干细胞在聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜上生长良好,形态呈梭形,细胞间连接紧密,分泌较多细胞基质。证明聚羟基丁酸/戊酸酯共聚物膜材料与人骨髓间充质干细胞有良好的生物相容性。

增强型绿色荧光蛋白-C_1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。

人脐带间充质干细胞致瘤性试验

目的:观察人脐带间充质干细胞对裸鼠的致瘤性。方法:培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液注射裸鼠。观察8周裸鼠体内有无肿瘤生长。结果:裸鼠注射细胞后无明显不适,8周观察期内裸鼠体内未见肿瘤生长,病理组织学检测未见异常。结论:人脐带间充质干细胞导致肿瘤发生的可能性低。

同源异体间充质干细胞上清液干预大鼠佐剂性关节炎

目的:探讨同源异体骨髓来源的间充质干细胞上清液对大鼠佐剂性关节炎的预防作用。方法:培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞,收集培养间充质干细胞48 h的上清液;将健康雄性SD大鼠右后足跖皮内一次性注射弗氏完全佐剂0.1 mL/只制作佐剂性关节炎模型,造模后行间充质干细胞上清液干预;造模前及造模后第7、14、21和28天测量大鼠体重和后足爪体积,同时观察大鼠生存状况;并于干预后第28天摄四肢关节X片并做病理检查。结果:间充质干细胞上清液干预组大鼠的原发性炎症和继发病变均不明显,关节X片检查和病理检查均未见明显异常;干预组与模型组大鼠相比,体重、足爪体积差异有统计学意义(P<0.05)。结论:间充质干细胞上清液可有效干预弗氏完全佐剂诱导的大鼠佐剂性关节炎的进展。

人脐带间充质干细胞过敏性试验

目的:观察人脐带间充质干细胞对豚鼠的过敏性反应,为临床使用人脐带间充质干细胞的安全性提供参考。方法:培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液。将30只豚鼠分成3组,分别是模型1组、模型2组和对照组。2个模型组隔日肌注细胞生理盐水混悬液3次,实验1组于首次注射后第14天,实验2组于首次注射后第21天分别静脉注射混悬液进行攻击。观察动物有无过敏反应症状。结果:动物无明显过敏反应症状,反应级数为0级。结论:人脐带间充质干细胞免疫原性低,不易导致过敏反应。

人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定

目的：探讨从人胎盘组织中分离羊膜间充质干细胞（hAMSCs）。方法：收集剖宫产足月胎儿胎盘，采用组织块贴壁法分离出羊膜问充质干细胞并传代培养，对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察，用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子CD73．APC、CD90-FITC、CIM4．PE、CDl05．Cy5．5和阴性分子CDllb-PE、CDl9．PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE，并采用六孔板法检测细胞增殖情况。结果：hAMSCs的细胞形态呈成纤维状，hAMSCs在培养3-d达到对数增长期，通过流式检测，发现细胞可表达CD73、CD90、CD44和CDl05，未表达CDllb、CDl9、CD34,CD45、HLA-DR。结论：从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞。

脐带间充质干细胞体外传代培养后细胞核型稳定性

目的：研究脐带间充质干细胞（uc-MSCs）在经过培养和传代后是否会出现染色体异常改变。方法：收集剖宫产足月胎儿脐带，采用胶原酶加胰酶消化法和机械法分离出UC-MSCs间充质干细胞贴壁培养传代，观察细胞形态、免疫表型及细胞增殖实验等生物学特性，利用G显带分析原代（Po）和第3～6代（P3～P6）细胞的染色体核型。结果：染色体核型分析显示,P0和P3～P6UC-MSCs均为正常二倍体核型，G显带未见染色体结构异常；UC-MSCs呈成纤维样形态生长，P3～P6代高表达CD73、CD90、CD44，并且UC-MSCs在培养2～3d时达到对数增长期。结论：UC-MSCs在体外连续传代培养6代以内染色体结构稳定，未出现染色体异常改变。

DEN-2 NGC株感染BALB/c小鼠TH1/TH2类细胞因子产生的差异

目的：通过观察2型登革病毒（DEN2）NGC株初次感染和再次感染BALB／c小鼠后小鼠血浆中TH1和TH2类细胞因子的产生及其动态变化，研究DEN2感染的免疫机制。方法：用不同量的DEN2NGC株经皮下多点注射，建立BALB／c小鼠感染模型，间接ELISA法测定感染后不同时间小鼠血浆IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的含量。结果：（1）在初、再次感染阶段，DEN2 NGC株各感染组产生IL-4、IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10与正常对照组有显著差异（P〈0．05）。①在初次感染阶段，NGC株各感染组血浆IL-2、IL-5、IL-6于第4、6、8天出现；在再次感染阶段，各感染组产生IL-2、IL-5、IL-6均于第1天迅速升高；IL-2水平于第4天达高峰（104448．46±13314．1pg／ml），维持5—7天后迅速下降；IL-5于48小时达到高峰（135．125±46．75pg／ml）；各组小鼠IL-6产生的动态相似，在再次感染后第1天，达高峰（555．823±44．639pg／ml）后逐渐下降。②初次感染早期，IL-4水平明显升高，而IFN-γ处于较低水平；再次感染后第1天，IL-4水平达最高峰（4294．668±349．038pg／ml），IFN-γ则于第4天和第11天达较高水平，两者的产生彼消此长，且产生动态与感染病毒量有关。（2）在初、再次感染阶段，用不同量DEN2 NGC株感染组产生细胞因子水平有差异。结论：DEN2 NGC株初次和再次感染BALB／c小鼠后，TH1和TH2应答均可发挥一定作用，二者相互影响，TH细胞及其产生的CK在DEN感染的发病机制中起重要作用。

移植MMSCs改善大鼠实验性心肌梗死后心室重构

目的探讨骨髓间充质干细胞(MMSCs)移植对大鼠实验性心肌梗死(MI)后心功能及心室重构的影响。方法开胸结扎冠状动脉左前降支(LAD)制作MI动物模型,造模成功后12～14d经舌下静脉移植已转染增强型绿色荧光蛋白(pEGFP-C1)的MMSCs,分4及8周检测动物的血流动力学、左心及全心质量指数、微血管密度测定、双盲计数法测定胶原含量,荧光显微镜观察绿色荧光的表达。结果移植组心率(HR)较同期模型组显著下降,4周时血压无明显改变,8周时则显著增高。移植组左心质量指数和全心质量指数均较同期模型组显著降低。移植组的微血管密度较同期模型组明显增高。移植组的胶原含量较同期模型组显著降低。结论移植MMSCs可改善实验性MI大鼠心功能及心室重构。

MSCs及其上清液预防大鼠佐剂性关节炎的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)及其上清液对大鼠佐剂性关节炎(AA)的预防作用。方法培养扩增SD大鼠骨髓MSCs,收集MSCs及其上清液。将健康雄性SD大鼠右后足跖皮内一次性注射弗氏完全佐剂0.1 ml/只造模。造模后行MSCs及其上清液干预。造模前1 d、造模后7、14、21、28 d测量大鼠体重和后足爪体积,同时观察大鼠生存状况。干预后第28天,行四肢关节X线片及病理检查。结果 MSCs干预组和上清液干预组大鼠,原发性炎症和继发病变均不明显,关节X线片和病理检查均未见明显异常,与模型组大鼠相比,体重和足爪体积差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MSCs及其上清液可有效干预弗氏完全佐剂诱导的大鼠AA的进展。

不同CD4^+T细胞计数的AIDS初治患者血清CK-MB水平研究

目的:观察不同CD4+T细胞计数的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)初治患者血清肌酸激酶同工酶MB型(CK-MB)的水平。方法:76例AIDS初治患者,按照外周血CD4+T细胞计数分为≥100个/μL组和<100个/μL组,采用免疫抑制法检测两组患者CK-MB水平。结果:76例AIDS初治患者中CK-MB异常12例,异常率15.79%;CD4+T细胞计数≥100个/μL组24例,CK-MB异常4例,异常率16.67%;CD4+T细胞计数<100个/μL组52例,CK-MB异常8例,异常率15.38%;两组异常率比较,差异无统计学意义(P<0.05)。结论:不同CD4+T细胞计数的AIDS初治患者的CK-MB异常率无明显差异。

骨髓间充质干细胞移植治疗缺血再灌注脑损伤

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSC）移植对缺血再灌注脑损伤的治疗效果及机制。方法采用线栓法制备缺血再灌注脑损伤SD大鼠模型。96只大鼠随机分为4组：模型组、MSC移植组、PBS对照组和假手术组，每组24只。取体外培养至第6代的骨髓MSC，经烟酸己可碱33342标记后，于造模24h后经阴茎静脉进行移植，对照组注射等量PBS。分别于实验第2、3、4、8、15、22天对各组大鼠进行神经损伤严重程度（NSS）评分，通过荧光显微镜观察MSC在脑组织内的定植情况，并对脑组织进行2，3，5-氯化三苯四唑（TTC）染色及神经干细胞、神经元、星形胶质细胞的特异性标志物[神经上皮干细胞蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）]的免疫组织化学染色。结果MSC移植后2d在受损的脑组织局部便可见蓝色荧光分布，并于15d时达到高峰。免疫组织化学结果显示，与模型组和对照组相比，MSC移植组大鼠受损脑组织局部Nestin、NSE、GFAP阳性细胞的数量均明显增多，差异均有统计学意义（P均〈0．05）。MSC移植组自第8天受损部位脑梗死的范围即出现显著缩小，NSS评分也明显下降，且与模型组及对照组比较，差异均有统计学意义（P均〈0．05）。结论骨髓MSC移植可有效增加缺血再灌注脑损伤局部神经干细胞、神经元、星形胶质细胞的数量，对神经损伤的修复起一定的促进作用。

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。

灵芝孢子粉和双歧杆菌对小鼠菌群失调的治疗作用

目的:研究灵芝孢子粉(GSP)、双歧杆菌(BB)对小白鼠肠道菌群失调的治疗作用。方法:用盐酸林可霉素注射液给实验小鼠灌胃0.36 g/kg连续6 d,建立小鼠菌群失调模型。将小鼠随机分成11组,每组10只,包括一个正常对照组(CG),一个菌群失调模型组(MIG)和9个治疗组(根据不同剂量和治疗方法建立的3个GSP治疗组,3个BB治疗组以及3个共同治疗组)。连续6 d后,处死小鼠,取直肠粪便并用生理盐水稀释成1×10-7、1×10-8、1×10-9三个稀释度,行有氧及厌氧培养48 h后作菌落计数,数据进行统计学处理。结果:成功建立了小鼠肠道菌群失调模型,MIG组的需氧菌和厌氧菌菌落计数均低于CG组,并且在经过GSP和BB治疗后小鼠肠道菌群数量明显得到恢复,其中高剂量灵芝孢子粉和高剂量双歧杆菌治疗组的效果最好,与CG组及相应中、低剂量组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:GSP和BB对治疗因抗生素引起的肠道菌群失调有显著的作用。

白纹伊蚊对登革病毒垂直传递能力研究

目的利用细胞及分子生物学技术，研究白纹伊蚊贵州省贵阳、兴义、毕节株对1—4型登革病毒（DEN1—4）的垂直传递能力。方法采集贵州省贵阳、兴义、毕节市市郊自然界白纹伊蚊，驯化3代。分别取羽化后3～5d龄成蚊为实验组，白纹伊蚊海南株为对照组；用DEN1—4国际参考株分别感染各组蚊虫，将感染后亲代及子1～3代成蚊制备蚊悬液，接种C6／36进行病毒分离并鉴定；间接免疫荧光法检测DEN抗原；常规方法提取总RNA。利用DENNS1基因区通用引物经逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测DEN核酸，限制性内切酶酶切分型。结果白纹伊蚊贵阳、兴义、毕节、海南株亲代蚊虫均对DEN易感；白纹伊蚊兴义株与海南株均能垂直传递DEN-1、4到子3代。传递DEN-3到子2代，白纹伊蚊兴义株能垂直传递DEN-2到子3代，白纹伊蚊贵阳．株能垂直传递DEN-1到子3代，传递DEN-2、3、4到子2代，白纹伊蚊毕节株能垂直传递DEN-1到子2代，DEN-4至子3代，未发现能垂直传递DEN-2、3。结论对DEN1—4易感的白纹伊蚊贵阳、兴义、毕节株能垂直传递DEN，且对DEN的垂直传递能力与其地理来源有关；贵州省3个地方株的白纹伊蚊卵可在干燥室温条件下越冬保存DEN。

MMSCs移植对大鼠心肌梗死后MMP-2,TIMP-2表达及心室重构的影响

目的:研究骨髓间充质干细胞(MMSCs)移植对实验性心肌梗死(MI)大鼠心肌细胞外基质金属蛋白酶(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-2)的表达及心室重构的影响.方法:采用开胸结扎冠状动脉左前降支(LAD)的方法制作MI大鼠模型,造模成功后12～14d经大鼠舌下静脉移植已转染增强型绿色荧光蛋白(pEGFP-C1)的MMSCs,分4,8wk2个时段检测大鼠左心及全心质量指数、胶原含量及MMP-2,TIMP-2的量效变化,荧光显微镜观察绿色荧光的表达.结果:4wk时移植组左心质量指数为[(1.69×10-3)±(11.02×10-5)],全心质量指数为[(2.22×10-3)±(5.08×10-5)]均较同期模型组[(1.83×10-3)±(9.48×10-5)],[(2.47×10-3)±(17.16×10-5]显著降低(P<0.01).8wk时其变化趋势与4wk时相同.4wk时移植组的胶原含量为(11.19±1.15)%较同期模型组的胶原含量(27.89±5.59)%显著降低(P<0.01),8wk时变化趋势与4wk时相同.移植组MMP-2的表达显著低于同期模型组中MMP-2的表达,而TIMP-2的表达在同期移植组与模型组间未见明显差异.结论:MMSCs移植可较为有效地改善大鼠实验性MI后的心室重构,其作用可能与降低心肌组织中MMP-2的表达有关,而非增加TIMP-2的表达.