人脐静脉内皮细胞制备饲养层对胚胎干细胞生长的支持作用

目的探讨人脐静脉内皮细胞是否可作为饲养层支持胚胎干细胞(ESC)的生长,维持ESC的未分化状态。方法取健康产妇产后的脐带,胶原酶灌注消化脐静脉血管,分离内皮细胞原代培养,并连续传代扩增细胞,Ⅷ因子相关抗原鉴定。采用生长良好的3代以上内皮细胞,经丝裂霉素C(10mg/L)灭活后制备饲养层,将E14.1 ESC接种到该饲养层上进行传代培养,观察ESC的形态学特征,测定不同传代时间的ESC碱性磷酸酶(AKP)活性、干细胞标志物Oct-4的表达,严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠体内畸胎瘤形成实验鉴定其全能分化特性。结果人脐静脉血管来源的内皮细胞能够在体外培养过程中生长、增殖旺盛,细胞连续传代10代以上能完整的保持正常的细胞形态学特征和生物学特性。经丝裂霉素C处理后细胞停止增殖,在24h内能较好的保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞的基本条件。E14.1 ESC在人脐静脉内皮细胞上传3～8代能较好的保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达AKP及干细胞因子Oct-4;体内全能分化实验显示:在内皮细胞上生长6代和10代以上的E14.1 ESC接种到SCID小鼠6周后均能形成畸胎瘤,含有3个胚层的组织细胞。结论人脐静脉血管内皮细胞可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效支持ESC的生长,克服了目前人ESC使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,解决了ESC临床应用的生物安全性问题。

胚胎干细胞诱导分化为造血干细胞重建造血功能的作用(英文)

目的探讨胚胎干细胞(ESC)定向分化来源的造血干细胞(HSC)体内重建造血功能的作用。方法将小鼠E14.1胚胎干细胞采用三步诱导法在体外分化发育为HSC,流式细胞仪检测HSC表面标志性抗原CD34+/Sca-1+的表达,体内畸胎瘤形成实验检测其致瘤性,造血克隆形成(CFU)实验观察其体外造血集落形成情况,免疫磁珠分选纯化HSC移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性小鼠观察其体内重建造血的功能。结果多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESC发育为含丰富造血前体细胞的胚胎体(EB),诱导14 d后,EB中CD34+/Sca-1+细胞数达峰值,为(13.72±2.07)%。收获此阶段的EB行第二步诱导分化16 d后,CD34+/Sca-1+细胞数可增至(24.62±2.50)%,CFU培养出现红系和粒系造血克隆;在骨髓基质细胞加胎肝基质细胞上清液培养体系中进行第三步诱导分化15 d后,CD34+/Sca-1+细胞达峰值,为(58.64±4.20)%,CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落,W right-G iemsa染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSC经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠,移植组小鼠+10 d造血功能开始恢复,观察40 d后除血小板恢复较慢外,白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常,植入率为71.4%,存活率为43.0%,染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论采用分阶段诱导的方法,可在体外定向诱导小鼠ESC分化发育为HSC,此来源的HSC较安全,无致瘤性,并具备体内重建造血功能的能力。

血管内皮生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）基因转染的骨髓间充质干细胞（MMSC）移植治疗肺动脉高压（PH）的疗效和机制。方法体外分离培养SD大鼠MMSC，将含有增强型绿色荧光蛋白的VEGF质粒转进MMSC。将SD大鼠随机分为4组：正常对照组、PH模型组；MMSC移植组，转基因移植组。一次性项背部皮下注射野百合碱（50mg,／kg），复制PH模型，观察21d后，MMSC移植组及转基因移植组分别给予浓度为5×10^5个细胞／ml和5×10^5个细胞／ml的MMSC悬液1ml静脉注射，模型组及正常组均给予等量L-DMEM液注射。移植后30d，观察4组大鼠一般情况、生存率、右心室收缩压（RVSP）、右心室肥大指数（RVH）、血气及肺小动脉的微观结构变化。结果移植后30d，MMSC移植组及转基因移植组大鼠的RVSP分别为（30．2±2．1）和（29．2±1．1）mmHg（1mmHg=0．133kPa），RVH分别为（37．9±3．2）％和（27．2±3．4）％，肺小动脉中膜厚度（MT）分别为（21．3±3．4）和（14．3±2．8）μm，肺小动脉管腔横截面积与血管总横截面积的比值（V／T）分别为（39．3±4．3）％和（43．0±1．5）％。上述指标与PH模型组相比差异均有统计学意义（P〈0．01）；其中MMSC移植组与转基因移植组间RVH、MT及V／T的差异有统计学意义（P〈0．05）。另外，MMSC移植组与转基因移植组动脉血气各指标较PH模型组均明显改善（P〈0．05）。同时观察到肺内损伤血管修复和血管新生现象。结论转染有VEGF165基因的MMSC移植可有效减轻并逆转野百合碱诱导的PH进程，此作用较单纯移植MMSC的治疗效果更加明显。其作用机制可能与血管修复及血管新生有关。