家畜繁育生物技术研究开发与产业化推广应用

家畜繁育生物技术包括人工授精、胚胎移植、体外受精、动物性别控制、动物克隆、转基因动物、干细胞等多元化的生殖生物工程技术。繁育生物技术的早期研究开发阶段主要集中在20世纪,到产业化推广应用经历了大约一个世纪的历程。目前,包括动物细胞性别控制、转基因-克隆技和干细胞技术已经进入产业化应用阶段,并且在人类疾病治疗方面显示了潜在的应用前景。

克隆清原马鹿的微卫星鉴定

为对体细胞克隆马鹿进行遗传鉴定,选取8对在牛中具有多态性的微卫星位点,通过筛选出在清原马鹿中具有高度多态性的引物,分别对体细胞克隆清原马鹿、清原马鹿供体细胞、受体清原马鹿进行微卫星分析。结果表明:清原马鹿的HUJ1177、BM888、BM757、IDVGA37、oarFCB304、RM12等6个微卫星位点的PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现多态性。经PAGE电泳分析,克隆清原马鹿与供体细胞的微卫星DNA基因型完全相同,而与受体清原马鹿的微卫星基因型明显不同。因此,体细胞克隆清原马鹿基因组来源于供体清原马鹿细胞而与受体无亲缘关系;HUJ1177、BM888、BM757、IDVGA37、oarFCB304、RM12等6个微卫星位点可用于克隆清原马鹿的鉴定。

牛输卵管上皮细胞培养、纯化及其生物学特性的研究

对牛输卵管上皮细胞进行了原代及传代体外纯化培养,并对输卵管上皮细胞的生物学特性通过普通光镜、扫描电镜、免疫组化、流式细胞技术进行观察、鉴定和检测等相关研究,建立了一种稳定的制备纯度较高的牛输卵管上皮细胞体外培养方法,为进一步研究胚胎共培养和核移植供体细胞奠定了基础。

奶牛体细胞核移植技术的商业化应用

为了提高奶牛体细胞核移植产业化生产应用效率,拟通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎的体外生产技术条件,达到高效生产优质奶牛克隆胚胎进行克隆奶牛生产的目的。结果表明,从生产效率的角度考虑,卵母细胞直接进行盲吸去核处理,供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2+5%O2+90%N2)的气相条件下进行体外培养,利用西门塔尔牛做受体可以大规模地进行高产奶牛的商业化克隆。

采用卵子-胚胎移植技术分析研究家畜受精和早期发育(英文)

为了阐明家畜受精及早期发育或者输卵管内未受精卵的变化过程,记述了4种卵-胚胎移植方面的研究:①将来自发情黄体期的猪卵母细胞移植到授精动物的输卵管内,可获得受精结果,但将卵移植到已经交配的猪输卵管内会导致多精受精。②把第7～8 d的猪孵化囊胚移植到同期处理的受体内,可以观察到胚胎成功发育到19～23 d。证明失去滋养外胚层的扩张囊胚可以承受移植的物理操作并保持发育能力,而且未交配受体的黄体寿命可以在第7 d和第8 d支持移植胚胎发育。③取2～6 mm直径发育卵泡的牛卵母细胞经体外成熟可以在授精小母牛的输卵管内正常受精,表明其具有受精和胚胎发育能力。④将马的卵母细胞移植到猪的输卵管内,卵母细胞到达子宫的时间仅需46～48 h,在此过程中没有发现未受精马卵的退化现象,暗示了输卵管中存在维持卵子生理机能的因子。综上所述,卵移植是研究家畜早期发育的有效分析技术。

性控冻精使用及相应的繁殖管理技术要点

性别控制是指通过人为地干预而繁殖出人们所期望性别后代的一种繁殖新技术。奶牛XY精子分离性别控制技术是指根据公牛精液中的x、Y精子的X染色体和Y染色体精子的DNA含量不同把这两种类型的精子有效的进行分离后．将含X染色体的精子分装冷冻用于牛的人工授精来控制生母率的技术；这种根据精子X、Y染色体的不同而分装冷冻的冻精就叫性控冻精。

巴美肉羊INHA和INHBA基因多态性与产羔数关系研究

为了研究INHA和INHBA这两个基因对巴美肉羊产羔数的影响,采用PCR-SSCP技术检测抑制素α亚基(α-inhibin,INHA)和βA亚基(βA-inhibin,INHBA)基因在巴美肉羊中的单核苷酸多态性。结果发现,引物1,4,6扩增片段有多态性,其余3对引物的扩增片段均不存在多态性。引物1,巴美肉羊有2种基因型AB型和AA型,平均产羔数AB型比AA型多0.17只(P<0.01)。引物4,巴美肉羊存在3种基因型(CC、DD和CD),巴美肉羊平均产羔数DD型比CC型多0.44只(P<0.01)。引物6,巴美肉羊有3种基因型(EE、FF和EF),EE型比EF型平均产羔数多0.21只(P<0.01),结果表明,抑制素α亚基(α-inhibin,INHA)和βA亚基(βA-inhibin,INHBA)基因是影响巴美肉羊产羔数的重要基因。

阿拉伯马染色体G带核型分析

为了比较阿拉伯马与普通马的差异,利用培养的阿拉伯母马体细胞,制备和分析了其染色体组型。试验采用体外培养的阿拉伯马成纤维细胞,用常规染色体标本制作技术,制备了阿拉伯马染色体G带,并完成了染色体组型配对分析。结果显示阿拉伯马染色体数目为2n=64,包括31对常染色体和1对XX性染色体。其中1~13号染色体为中或亚中着丝粒染色体,14~31号染色体为端着丝粒染色体,X染色体则为第2对大亚中着丝粒染色体。G带核型显示阿拉伯马染色体G带明暗相间,每对染色体都有独特的带纹特征。本研究是首次在国内报道阿拉伯母马染色体G带特征。这将为阿拉伯马细胞遗传学研究和疾病诊断提供资料,也将为认识阿拉伯马与普通马的不同提供细胞水平的依据。

小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。

小鼠原始生殖细胞迁移过程中macroH2A的表达

通过单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法,探讨了小鼠原始生殖细胞(PGCs)性别分化与macroH2A的关系。结果表明:PGCs在迁移过程中,macroH2A在细胞核中的表达越来越弱,而在细胞质中的表达越来越强;到达生殖嵴性别分化结束后,雄性PGCs中macroH2A在细胞核和细胞质中基本不表达,而在雌性PGCs细胞质中发现mac-roH2A大量表达。据此推断,macroH2A可能与后期的DNA印记快速擦除及性别分化后细胞分裂相关。

H2A.X在不同时期小鼠原始生殖细胞核质区分布

以小鼠为研究对象,研究H2A.X在不同时期原始生殖细胞(PGCs)核质区的分布。结果表明:PGCs在迁移过程中,8.5、10.5、11.5dpc时H2A.X在PGCs细胞核和细胞质中呈弥散分布;13.5dpc时H2A.X在PGCs细胞核和细胞质中均有分布,但雌性小鼠PGCs中H2A.X主要集中于细胞核,而雄性主要集中于细胞质。结果提示H2A.X在PGCs中的表达可能与其性别分化后精原细胞和卵母细胞的细胞周期维持密不可分。

甘油稀释液的加入方法对公牛精液冷冻后活力的影响

为探讨甘油稀释液的加入方法对公牛精液冷冻后精子活力的影响,以不同的加入方法(A组一次加入法,B组二次加入法)进行了试验比较。结果表明:稀释、平衡后平均精子活力A组低于B组(P<0.05);精清中谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)平均渗出量A组高于B组(P<0.05)。冷冻后平均精子活力A组低于B组(P<0.05);精清中谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)平均渗出A组高于B组(P<0.05)。甘油稀释液采用二次加入法优于一次加入法。

稀释液不同甘油浓度对公牛精子活力及相关酶渗出量的影响

为探讨牛冷冻精液稀释液中不同甘油浓度对精子活力及相关酶渗出量的影响,以不同甘油浓度(A组5.0%、B组7.0%、C组9.0%)进行了试验比较。结果表明:A、B、C组的渗透压值分别为1196.4±4.16mmol/kg、1532.2±7.19mmol/kg、1733.4±2.88 mmol/kg,组间差异显著(P<0.05),证实稀释液中甘油量的增加可引起渗透压的升高。精液经稀释平衡后,精子活力A组高于B、C组(P<0.05);精清中谷草转氨酶(AST)的渗出量,A组低于B、C组(P<0.05);乳酸脱氢酶(LDH)的渗出量A组低于B、C组(P<0.05),B组与C组差异不显著(P>0.05)。冷冻后,精子活力A组高于B、C组(P<0.05);精清中谷草转氨酶(AST)的渗出量A组低于B、C组(P<0.05);乳酸脱氢酶(LDH)渗出量A组低于B、C组(P<0.05)。试验显示,高浓度甘油对精子活力的影响,主要是渗透压变化所致。AST、LDH渗出量的高、低可印证精液中精子细胞受损程度。5.0%甘油浓度的稀释液为最理想。

绵羊卵母细胞体外培养Ghrelin mRNA的表达

为揭示Ghrelin在绵羊卵母细胞的表达情况,运用实时定量RT-PCR技术检测不同培养系统中绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的相对表达量。结果表明,以M199和血清为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞GhrelinmRNA相对表达量均显著上升,仅以M199为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞Ghrelin mRNA相对表达量均显著下降。在不同基础培养基中添加不同激素后,E2较FSH和LH有促进Ghrelin mRNA相对表达量升高的趋势。绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的表达以及在不同培养系统动力学变化,提示了这一新型分子在卵母细胞成熟过程中受激素潜在的调控作用。

用荷斯坦奶牛性控精液生产体内性控胚胎

采用荷斯坦奶牛X性控冻精和超数排卵技术结合生产奶牛性控胚胎,以建立高效、低成本的体内性控胚胎生产方法。研究发现,使用CIDR和Cue-Mate进行奶牛同期发情处理,发情率分别为90.9%和100%(P<0.05),且Cue-Mate的发情时间更加集中;加拿大的FOLLTROPIN-V和中国科学院动物研究所的FSH对奶牛超排效果影响不显著,分别为头均胚胎数10.08枚±8.08枚、头均可用胚胎数2.38枚±3.07枚和头均胚胎数6.57枚±4.31枚、头均可用胚胎数2.00枚±1.88枚,无显著差异(P>0.05);奶牛发情后12h～14h和16h～19h人工授精,分别获得头均胚胎数10.25枚±5.53枚、头均可用胚胎数5.33枚±4.52枚和头均胚胎数10.13枚±6.93枚、头均可用胚胎数5.88枚±6.26枚,无显著差异(P>0.05)。但是未受精胚胎数差异显著(27对7,P<0.05)。

表皮生长因子对牛输卵管上皮细胞生长、增殖和凋亡的影响

研究不同浓度的表皮生长因子对牛输卵管上皮细胞生长、增殖和凋亡的影响,目的是建立高质量的牛体外胚胎共培养细胞系。牛输卵管上皮细胞体外培养技术结合血球计数法检测细胞增殖,并利用流式细胞仪进行细胞周期和凋亡的检测,通过Lysis软件对数据进行分析。结果表明,EGF在0～50 ng/mL浓度范围内,其促增殖、抑制凋亡作用随浓度的增加而增大,呈剂量依赖性;当浓度持续增高时,其促增殖、抑制凋亡能力降低;此外,S期细胞数量明显增加,G2-M期细胞数量有下降趋势。表皮生长因子在一定浓度范围内具有促进牛输卵管上皮细胞增殖和抑制其凋亡的作用,并使其细胞周期发生变化。

阿巴嘎黑马染色体核型及G带分析

采用耳组织成纤维细胞培养方法及常规染色体标本制备技术,对阿巴嘎黑马的染色体核型及G带进行了分析。结果显示,阿巴嘎黑马染色体数目为2n=64,雄性核型为64,XY;雌性核型为64,XX。其中1～13号染色体为中或亚中着丝粒染色体,14～31号染色体为端着丝粒染色体,X染色体则为2对大亚中着丝粒染色体,Y染色体为最小的端着丝粒染色体。另外,阿巴嘎黑马染色体G带明暗相间,且每对染色体都有其独特的带纹特征,其中部分染色体的G带与已报道的阿拉伯马的G带特征有明显差异。本研究首次在国内报道了阿巴嘎黑马染色体核型及G带特征,这将为阿巴嘎黑马的细胞遗传学研究和疾病诊断提供资料。

荷斯坦牛生产体内性控胚胎的试验研究

本研究采用荷斯坦牛X-性控冻精和超数排卵技术生产奶牛体内性控胚胎。结果显示,使用阴道栓(Cue-Mate)对31头供体奶牛进行同期发情处理,发情率为100%,且发情时间较集中。31头供体奶牛共回收胚胎321枚,头均回收胚胎10.35枚,其中可用胚胎225枚,头均可用胚胎7.26枚。选择36头黄牛受体进行单胚移植,其中21头移植鲜胚,妊娠10头,妊娠率47.62%;15头移植冻胚,妊娠6头,妊娠率40.00%。

哺乳动物线粒体遗传和在体细胞克隆胚胎中的命运

线粒体是哺乳动物重要的细胞器之一,为细胞的生命活动提供能量。线粒体是除细胞核外唯一含有功能性基因组DNA的细胞器。由于线粒体在哺乳动物早期胚胎的发育中有多方面重要的作用,因此线粒体对体细胞克隆胚胎发育的影响成为体细胞克隆动物研究的热点。就线粒体的结构特点和遗传特性及其在同种、异种动物克隆早期胚胎发育过程中的命运以及可能的遗传机制进行综述。同时,也将比较注射异源线粒体后,线粒体在注射胚胎中的发育命运。

Xist基因抑制对牛SCNT早期胚胎发育的影响

Xist是与X染色体失活相关的非编码基因,它在合子期基因组开始表达,是胚胎发育早期表达的第一个印记基因。探讨了特异性抑制Xist的TALER-REPRESSOR(TALER)载体转染到胎牛成纤维细胞对Xist基因的抑制作用,并以抑制Xist基因表达的细胞作为核供体制作克隆胚胎,研究Xist基因抑制对牛克隆胚早期发育的影响。结果显示,与对照组细胞相比,TALER载体将Xist相对表达量下调了93.85%,说明本试验设计的载体转染系统能够有效抑制Xist基因的表达。选取Xist抑制表达阳性的转染细胞用于体细胞核移植试验,克隆胚胎发育结果显示,试验组和对照组的卵裂率、8细胞发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率分别为78.8%vs 75.1%(P>0.05,无显著差异)、54.4%vs 50.6%(P>0.05,无显著差异)、12.3%vs 27.8%(P<0.01,差异极显著)、0 vs 26.6%(P<0.01,差异极显著)。综上所述,试实验设计的特异性抑制Xist表达的TALER载体可有效抑制雌性胎牛成纤维细胞中Xist的表达。供体细胞Xist这种基因下调可使克隆胚胎2-8细胞率略有提升,但囊胚期和桑葚胚率明显降低。因此,其机制尚待于进一步探讨。