一种高效快速浓缩腺相关病毒载体的方法

腺相关病毒载体(adeno associatedviralvector,AAVvector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。研究中往往需要高滴度的重组AAV病毒(>105v g /细胞),为此利用完整的腺相关病毒颗粒具有耐受有机溶剂的特点,创造性地采用了一种用乙醇沉淀重组AAV病毒的方法,达到了高效、快速浓缩AAV载体的目的。结果表明,乙醇沉淀法可以高效浓缩AAV载体,并且对病毒的结构和活性没有明显影响。用这种方法可以方便地将低滴度的AAV病毒变成高滴度,解决动物体内实验中每点注射体积受到限制的问题。

减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选asd基因缺失株SL1344Δsse K1Δasd。将携带有asd基因的无抗性p YA3493质粒电转至上述缺失菌株SL1344Δsse K1Δasd,构建SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)重组菌株。结果:PCR及测序结果表明SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)构建成功。进一步研究表明重组菌株SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)血清型和强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相同,且能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相比均无明显差异。小鼠毒力试验表明,SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为5.24×108CFU,毒力较强毒株SL1344约下降至0.048%;免疫保护效力试验显示,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率,与亲本株SL1344Δsse K1基本一致。结论:以上结果表明,鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-载体平衡致死系统构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。

AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究

本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应。用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用。结果表明:对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞。在MOI为1000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用。结论:AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小。AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景。

携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备

目的:构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体.方法:将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA(VEGF165)片段插入载体质粒pSNAV2.0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2.0-EGFP-U6-shRNA(VEGF165).以HSV1-RapCap/ΔUL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒.对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测.结果:PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98%以上.点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×1014v.g.(vector genomes)/L.EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30%以上.结论:成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础.

人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的 克隆人ＬＩＧＨＴ基因，构建其重组腺病毒载体，以研究ＬＩＧＨＴ过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响。方法用ＲＴ－ＰＣＲ法从人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中克隆人的ＬＩＧＨＴ全长基因。将ＬＩＧＨＴ ｃＤＮＡ克隆到穿棱载体ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＬＩＧＨＴ重组质粒中，经酶切线性化后，将重组质粒ｐＡｄＴｒａｃｋ－ＣＭＶ－ＬＩＧＨＴ和骨架质粒ｐＡｄＥａｓｙ－１，以电穿孔法共转染大肠杆菌ＢＪ５１８３，获得重组腺病毒质粒。最后，将线性化的重组腺病毒质粒转染２９３细胞包装获得重组腺病毒，用荧光显微镜、ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析ＬＩＧＨＴ基因的表达。 结果 用ＲＴ－ＰＣＲ法从人的ＰＢＭＣ中，扩增出７２３ ｂｐ的ｃＤＮＡ，测序证实为人ＬＩＧＨＴ基因。荧光显微镜、ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实，ＬＩＧＨＴ重组腺病毒可感染２９３细胞，并在２９３细胞内进行有效的复制。结论成功地克隆了人ＬＩＧＨＴ基因，并构建了其重组腺病毒载体，为进一步研究ＬＩＧＨＴ基因的功能提供了条件。

Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感染B16F10细胞,通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果,Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况,CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明,成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA,纯化的慢病毒滴度为1×10^(8) TU·mL^(-1),建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,mRNA的沉默效率约为75%(P<0.01),发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量,降低B16F10细胞活力。以上结果表明,干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性,促进B16F10细胞死亡,这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。

rAAV2-GPⅡb/GPⅢa载体构建和体外表达、功能实验

为了研究rAAV载体介导的血小板无力症基因治疗的可行性,构建了由CMV启动子调控的rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒载体,并采用多种方法验证了rAAV2-Ⅱb和rAAV2-Ⅲa病毒载体在真核细胞中的表达能力,其中包括用RT-RCR方法检测BHK-21细胞感染24小时(MOI=1×105v.g/cell)后目的基因在mRNA水平的表达,用流式细胞术的方法检测不同MOI和目的基因表达之间的量效关系,采用Westernblot的方法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=1×105v.g/cell)目的基因在蛋白水平的表达,用免疫荧光法检测BHK-21细胞感染48小时后(MOI=105v.g/cell)目的基因在细胞表面的表达,以及应用PAC-I结合试验验证所表达的GPⅡb/Ⅲa蛋白功能。结果表明,在MOI=1×105v.g/cell条件下,在BHK-21细胞感染24小时后即可在mRNA水平上检测到目的基因的表达,在48小时可在蛋白水平检测到目的基因的表达;在一定剂量范围内目的基因的表达量随着MOI的增加而增加,但MOI过高反而使表达量下降,目的基因表达产物活化之后能与PAC-I结合,并具有正常的生物学活性。结论:rAAV2载体能有效地介导GPⅡb、GPⅢa基因在真核细胞内表达,所表达的产物都具有正常的生物学活性,此结果为rAAV2载体在血小板无力症基因治疗中的应用打下了基础。

水凝胶角膜给药载体治疗大鼠角膜炎的实验观察

目的观察水凝胶角膜给药载体对大鼠角膜炎的治疗效果。方法建立金黄色葡萄球菌角膜炎动物模型,SD大鼠随机分为5组:分子印迹聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯与甲基丙烯酸的共聚物P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体组、聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯与甲基丙烯酸的共聚物P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体组、聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯(PHEMA)水凝胶角膜给药载体组、加替沙星眼药水组、自愈组,每组各3只,分组进行饲养。比较各组角膜结膜情况并进行角膜细菌划线培养和病理组织学观察。结果角膜炎大鼠干预后48 h进行检测,自愈组划线细菌培养与干预前无明显差别,PHEMA组划线菌落培养少于干预前,而加替沙星眼药水组、P(HEMA-CO-MAA)组及分子印迹P(HEMA-CO-MAA)组划线菌落培养明显少于干预前。角膜冰冻切片行HE染色,各组均可见水肿,相对于眼药水组,P(HEMA-CO-MAA)及分子印迹P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体组角膜基质水肿程度较弱,炎症浸润细胞较少。结论 P(HEMA-CO-MAA)和分子印迹P(HEMA-CO-MAA)水凝胶角膜给药载体比PHEMA水凝胶角膜给药载体杀菌效果强,更具有未来长效缓释的研究价值。

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的构建编码hVEGF165mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法以hVEGF165mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。结果构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功。靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显。结论成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒。

重组腺相关病毒载体介导成纤维细胞生长因子2基因诱导缺血心肌血管新生

探讨重组 2型腺相关病毒载体介导 2型成纤维细胞生长因子基因诱导家兔缺血心肌血管生成的作用。实验对象为 2 0只新西兰兔 ,手术建立心肌缺血模型后随机分为成纤维细胞生长因子基因治疗组和对照组 ,分别向缺血区域心肌注射成纤维细胞生长因子腺相关病毒或磷酸盐缓冲液。 4周后取心肌及肝、肾等器官组织标本 ,采用逆转录聚合酶链反应检测目的基因mRNA的表达 ;制作组织学切片以观察组织病理改变 ,于高倍镜下计数缺血区域微血管数目。结果发现转染的 2型成纤维细胞生长因子基因在缺血心肌中有表达 ,成纤维细胞生长因子基因治疗组缺血区域单个高倍视野内的微血管数为 12 .0± 1.4条 ,对照组为 4 .5± 1.5条 ,二者差异具有显著性 (P <0 .0 1)。 2型成纤维细胞生长因子基因治疗组的肝脏、肾脏、脾脏、角膜和睾丸标本中均未发现 2型成纤维细胞生长因子基因的表达 ,病理检查也未发现组织结构异常。说明腺相关病毒载体介导的 2型成纤维细胞生长因子基因可以有效地转染入家兔缺血心肌 ,并具有明显的诱导缺血心肌血管生成的作用 ,且基因表达仅限于心肌。

病毒载体介导血管内皮生长因子基因表达对大鼠脑缺血后齿状回神经发生的影响

目的观察重组腺相关病毒(rAAV)载体介导人源血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转移表达对成年大鼠缺血性脑损伤后,海马齿状回神经前体细胞增殖水平的影响。方法SD大鼠27只,随机分为rAAV2组(18只)和对照组(9只),将携带hVEGF165基因的rAAV颗粒立体定向给药至rAAV2组大鼠右侧海马2周后,全部大鼠采用4血管闭塞方法建立大鼠缺血性脑损伤模型,于缺血后6、24和48天时,各组随机选取1/3的大鼠处死,分别应用RT-PCR和免疫组织化学染色法检测大鼠海马hVEGF165 mRNA的表达水平或齿状回神经前体细胞的增殖水平。结果荧光显微镜下观察,rAAV2组大鼠海马齿状回均可见报告基因增强型绿色荧光蛋白的表达;rAAV2组大鼠缺血后6、24和48天时,均有海马hVEGF165 mRNA表达,3个时间点比较无统计学差异(P>0.05);rAAV2组大鼠缺血后6、24和48天时,齿状回神经前体细胞增殖水平较对照组显著增高(P<0.05)。结论rAAV载体可介导目的基因hVEGF165高效转染海马神经元,并促进缺血诱导的齿状回神经前体细胞增殖。

重组腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165基因对缺血心肌血管新生的影响

为了研究重组 2型腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF16 5 )基因对兔缺血心肌血管新生的影响 ,选取了 4 0只新西兰兔 ,建立心肌缺血模型后随机分为血管内皮生长因子高、中、低剂量组及对照组等 4组 ,分别向缺血区域心肌注射不同剂量的腺相关病毒载体 人血管内皮生长因子 16 5或磷酸盐缓冲液。 4周后取心肌组织和血液标本 ,采用逆转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附法检测人血管内皮生长因子 16 5基因的表达 ;制作组织学切片以观察心肌组织的病理改变 ,于高倍镜下计数缺血区域毛细血管数目。结果发现 ,血管内皮生长因子低、中、高剂量组的人血管内皮生长因子 16 5 GAPDHmRNA比值依次为 0 .14± 0 .0 3、0 .4 0± 0 .0 4和 0 .6 4± 0 .0 4 ,血清人血管内皮生长因子 16 5含量分别为 6 4 .6± 8.0ng L、32 7.1± 9.9ng L和 4 71.6± 6 .9ng L ,各组间的差异均具有显著性 (P <0 .0 1)。低、中、高剂量组单个高倍视野内的毛细血管数分别为 4 .6± 1.3、11.6± 1.8和 2 1.8± 3.1条 ,而对照组为 4 .5± 1.5条。高、中剂量组的毛细血管数显著高于对照组 (P <0 .0 1) ,而低剂量组与对照组相比差异无显著性 (P >0 .0 5 )。相关分析发现毛细血管数与腺相关病毒载体 人血管内皮生长因子 16 5剂量呈?

锅炉用高温气相有机热载体自燃点的试验研究

简要介绍了有机热载体及自燃点的定义,特别是锅炉用高温气相有机热载体的自燃点特殊性能。总结了近7年中常见锅炉用高温气相有机热载体样品的自燃点数据,可以为高温气相有机热载体型式试验提供重要数据,为其在锅炉中的日常安全运行提供有效保障。

密级标识技术在涉密信息化系统与涉密载体中的应用研究

随着现在社会互联网技术的不断发展,互联网安全对于社会以及国家都具有很重要。尤其是对于国家安全保密,涉密信息化系统与涉密载体的信息安全至关重要。涉密信息系统的基础测量标准和重要测量评项正是密级标识,对分级保护工作有至关重要的意义。通常而言涉密信息储存在光电磁介质涉密载体中,因此若想对涉密信息进行保护必须加强该载体的保密程度。在此基础上本文针对密级标识技术进行了相应的研究,希望能为相关研究领域提供参考。

有机热载体炉爆管事故的原因分析与处置

爆管是有机热载体炉最常发生的事故。无论是辐射受热面还是对流受热面管子，都会发生爆管。

DMD基因治疗中AAV载体优化的研究进展

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一种由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)编码基因突变引起的进行性肌肉萎缩疾病,机体无法产生正常功能的dystrophin,最后由呼吸肌或心肌衰竭引发成年早期死亡。全身系统性基因治疗是最大程度治疗DMD的最有效方法。腺相关病毒(adeno-associated virus vector,AAV)是当前极具应用前景的基因治疗载体,在多种遗传性疾病的临床治疗中取得了前所未有的成功。然而,针对DMD的AAV载体基因治疗仍面临巨大挑战,包括无法容纳dystrophin全长编码序列,载体的肌肉靶向性不足且大量滞留在肝脏,AAV在体内大幅降解严重降低转导效率,机体对AAV衣壳蛋白产生免疫反应,AAV规模化制备的实施难度,以及安全性风险等。AAV载体优化旨在利用基因工程技术改变其相关特性以定制适用于DMD基因治疗的最佳载体。本文综述了AAV载体优化的方向及策略,以期跨越DMD基因治疗的障碍。

腺相关病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ基因在CD34^+造血干/祖细胞中的表达

目的研究2型重组腺相关病毒(rAAV-2)介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在脐血CD34+细胞及其子代细胞中的表达。方法采用rAAV-2/hFⅨ转导经预刺激的人脐血CD34+细胞,分别向粒单系、巨核系和红系分化培养21d,从转录水平、蛋白质水平和其功能活性检测hFⅨ的表达,同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、各系标志分化抗原的表达及集落产率来评估rAAV-2对其增殖分化能力的影响。结果经测序证实转导组子代细胞的RNA可扩增出hFⅨcDNA片段,上清液中可检测到hFⅨ抗原的表达,每24h分泌量达14.10ng/106细胞。转导组和未转导组细胞培养21d后其活力、增殖倍数、标志性分化抗原的阳性率及集落产率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论rAAV-2/hFⅨ能有效地转导人脐血CD34+细胞并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,且对其体外培养21d的细胞增殖分化能力无明显影响。

老电影载体民间保护钩沉

老电影载体的民间保护,是以挖掘,搜集,整理,保存,展示老电影载体为内容的民间文化活动现象。从保护老电影载体中思考电影存在的历史和文化价值,初步探寻实践老电影保护的文化追求,借老电影载体给人们的精神世界注入活力与信心。老电影爱好者对电影怀抱着极高的爱,恨,恐,恋情感,饱含着极高的热度。电影是上一个世纪之交人类最伟大的创造,每一位老电影爱好者都不同程度地怀有"迷影"情结。