中医药院校实验动物学教学改革的几点思考

对实验动物学教学进行了大胆的改革,提出了该课程应加强动手能力的培养,因人施教,增强人文关怀等指导思想。通过改进教学方法,探索适合中医药高等院校的教学模式,培养合格中医药人才。

从中医药角度探讨阿尔茨海默病与糖尿病的关系

目前研究认为,阿尔茨海默病(AD)与糖尿病(DM)关系密切,DM有可能增加患AD的风险,甚至认为AD是一种大脑糖尿病,称之为3型糖尿病,与2型糖尿病(T2DM)关系密切,二者存在一致的疾病生理机制。本文从中医药病机和临床科研角度出发,探讨AD与DM在中医病机及临床方药应用、实验研究的共性,指出随着对二者发病机制和中医理论应用研究的深入,可挖掘出更多AD与DM两者共同的机制和有效方药,为多元化研究治疗AD和DM,并为异病同治、早期干预提供新的方向和思路。

中医实验动物模型研究之我见

自20世纪60年代初肾阳虚证动物模型问世以来,中医证候动物模型的研制已经历了40多年的发展。中医证候动物模型的研究,长期处于制作模型的初级阶段,对于模型的完善、定型及使用尚不完善,且真正依据中医理论制作的模型也不多,这些缺陷都随着中医动物模型研究的加速发展趋势,而变得愈加突出。研制开发中医证候动物模型,对于验证传统中医基础理论的实质内涵及其科学性,发现新问题,探求新规律,丰富和创新中医基础理论,此外,用与中医临床研究相互补充,为中医理法方药的疗效及其作用机理提供科学客观的依据,为中药新药的研制开发以及进入国际市场提供科学依据等有着至关重要的作用。中医证候动物模型的研究和复制,必须在中医学理论指导之下进行,其造模因素必须有直接的中医理论依据,且使现有模型在应用中得到验证、完善、定型,从而使得中医证候动物模型学成为中医理论指导下的系统学科。但是,在中医证候动物模型的发展中也存在一些问题,笔者就中医实验动物模型的建立,提出一些自己的观点供研究者参考。

中医院校实验动物教学的思考与实践

高校担负着培养高素质人才的重任,为了能够让学生学有所成,高校必须要重视人才培养,以培养优秀人才为旨归,这就要求每一位高校从教人员必须根据时代发展的需要,结合自己所授课程的特点,对自己的教学理念、教学方法进行反思并适时地予以调整。

基础医学动物实验教学经验初探

在生命科学领域中,实验动物作为医学实验的最基本的研究条件之一,在现代医药学的实验研究中有着不可替代的作用。作为医药专业学生,将所学医药知识应用于实践,必先经过动物实验。因此,动物实验及动物实验操作基本技能就成为学习实验动物学的重中之重。实验动物学实验教学应注重动物福利,增强人文关怀等指导思想,加强动手能力的培养,并强调做好自身防护确保实验者自身安全。本文介绍本人在动物实验教学中积累的少许经验,以作抛砖引玉。

沙门氏菌感染对动物实验的影响

沙门氏菌是在现代动物生产养殖业中最为常见的传染病,也是造成经济损失最大的疾病之一,同时又是研究学者和生产管理者最想彻底克服的疾病。本文通过细致分析沙门氏菌在不同动物体中各个方面的临床症状与病理剖检变化,进而推导出试验中沙门氏菌对动物疾病诊断,动物实验的影响。指出生产管理中健全的规章制度的重要性,为在动物实验中,排除其他因素对实验结果的影响提供一定的数据支持,从而提高实验的成功率与准确性。

支气管哮喘实验动物模型的研究进展

通过对近年来国内外建立的支气管哮喘动物模型的研究进行总结,从常用动物的选择、模型的分类到模型的应用及仍然存在的问题等方面进行综合分析,强调在实际运用时,不应该拘泥于某一种模型,而应该根据实验目的选择最能敏感地反映出研究指标的动物模型。

动物实验设施净化空调系统节能设计浅谈

动物实验设施主要应用于实验动物的饲养繁育及进行相关的动物实验。净化空调系统是现代实验动物设施中的重要设施，启用后需连续运转，属能源消耗型设施。参照动物实验设施国家标准，本着实用、标准、经济的原则进行节能设计。

甘草次酸对大肠癌HT-29细胞化疗增敏作用机制研究

目的:研究甘草次酸增强奥沙利铂对大肠癌HT-29细胞化疗敏感性的作用机制。方法:将大肠癌HT-29细胞分为对照组、甘草次酸组(甘草次酸浓度为100μmol/L)、联合组(100μmol/L甘草次酸+25 mg/L奥沙利铂)和阳性对照组(奥沙利铂25 mg/L)。采用四氮唑蓝法检测各组HT-29细胞增殖率;通过Annexin V/PI双标流式细胞术检测各组HT-29细胞凋亡比例;通过蛋白质印迹法检测各组HT-29细胞中核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、激活型胱天蛋白酶3(caspase-3,CASP-3)蛋白表达。结果:与对照组相比,联合组和阳性对照组HT-29细胞增殖率降低(P<0.05),联合组和阳性对照组凋亡细胞比例均升高(P<0.05);甘草次酸组、联合组和阳性对照组NF-κB、Bcl-2蛋白相对表达量均降低(P<0.05),而激活型CASP-3蛋白表达升高(P<0.05)。结论:甘草次酸可能通过调控NF-κB信号通路增强奥沙利铂对大肠癌HT-29细胞的化疗敏感性。

脑性瘫痪三大病因学动物模型的建立方法概述

小儿脑性瘫痪（简称脑瘫）是指小儿在出生前到出生后1个月内，由非进行性脑损伤导致的综合征，是小儿神经系统常见的病症之一，是导致儿童肢体残疾的主要疾病之一。它主要临床表现为运动功能缺陷，姿势异常，同时还常合并语言障碍、智力发育迟缓、感知觉、行为和情感异常、癫痫及学习困难等症状。

基于肠脑轴探讨地黄饮子对APP/PS1转基因阳性小鼠神经功能的改善作用及机制

目的探讨地黄饮子对APP/PS1转基因阳性小鼠神经功能的改善作用及可能机制。方法将APP/PS1转基因阳性小鼠随机分为APP/PS1阳性模型组,地黄饮子低、中、高剂量(12、24、48 g/kg,按生药量计)组和西药组(盐酸多奈哌齐0.8 mg/kg),并以APP/PS1转基因阴性小鼠作为APP/PS1阴性正常组,每组6只。各药物组小鼠灌胃相应药液,APP/PS1阳性模型组和APP/PS1阴性正常组小鼠灌胃同体积生理盐水,每天1次,连续28 d。末次给药后,考察各组小鼠的学习和记忆能力,肠道菌群多样性(仅地黄饮子中剂量组)、海马组织神经细胞病理改变,以及Bcl-2、Bax、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达情况。结果与APP/PS1阳性模型组比较,地黄饮子中、高剂量组小鼠的逃逸潜伏期显著缩短,穿过原平台次数显著增加(P<0.05)。与其余组比较,地黄饮子中剂量组的Chao1指数更低,Shannon指数更高(P<0.05),且其微生物菌群的操作分类单位(OTU)丰度有所降低,优势菌种为梭菌纲o_Clostridia_vadinBB60_group、疣微菌g_UCG_005。与APP/PS1阳性模型组比较,地黄饮子中、高剂量组小鼠海马CA1区神经细胞病理改变有所改善,其海马组织中Bcl-2、BDNF蛋白的表达均显著上调,Bax蛋白的表达均显著下调(P<0.05)。结论地黄饮子可增强肠道菌群多样性,改变优势菌种,并能抑制大脑神经细胞凋亡,提高BDNF水平;其作用机制可能是借助肠脑轴来保护神经细胞,从而提高APP/PS1阳性模型小鼠的学习和认知能力。

化瘀祛痰方通过调控HIF-1α/VEGF/VEGFR-2通路影响动脉粥样硬化家兔主动脉脂质斑块

目的研究化瘀祛痰方调控HIF-1α/VEGF/VEGFR-2通路对动脉粥样硬化家兔主动脉脂质斑块的影响,探讨化瘀祛痰方对动脉粥样硬化脂质斑块的作用机制。方法将60只新西兰家兔随机分为对照组15只,实验组45只。实验组45只家兔通过免疫性内皮损伤合并高脂饲料喂养的方法制备动脉粥样硬化模型,对照组喂饲普通饲料。8周后,将实验组家兔随机分为模型组、化瘀祛痰方组及辛伐他汀组。各组给予相应药物干预,对照组、模型组给予同体积生理盐水,每天1次,连续4周后取材。全自动生化分析仪检测各组血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）含量;HE和油红O染色观察家兔主动脉病理形态学改变,测量内膜、中膜厚度;免疫组化法测定CD31平均光密度值;ELISA检测血清缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）含量;Western blot法检测主动脉HIF-1α、VEGF、VEGFR-2蛋白表达。结果模型组血清TG、TC、LDLC水平较对照显著升高（P〈0.01）,HDLC水平显著降低（P〈0.01）,而化瘀祛痰方组和辛伐他汀组血清TG、TC、LDLC含量较模型组降低（P〈0.05或P〈0.01）,HDLC含量均升高（P〈0.05或P〈0.01）。病理染色可见模型组主动脉内膜细胞增生,有大量泡沫细胞和脂质沉积,经化瘀祛痰方和辛伐他汀治疗后均可见明显改善。模型组内膜、中膜厚度较对照组显著增厚（P〈0.01）,而化瘀祛痰方组和辛伐他汀组较模型组显著减小（P〈0.01）。模型组主动脉CD31平均光密度值较对照组显著升高（P〈0.01）,而化瘀祛痰方组和辛伐他汀组较模型组显著降低（P〈0.01）。模型组血清HIF-1α和VEGF含量较对照组显著升高（P〈0.01）,而化瘀祛痰方组和辛伐他汀组较模型组均降低（P〈0.05或P〈0.01）。模型组主动脉HIF-1α、VEGF、VEGFR-2蛋白表达较对照组显著升高（P〈0.01）,经化瘀祛痰方和辛伐他汀治疗后,两组主动脉HIF-1α、VEGF、VEGFR-2蛋白表达水平较模型组均有显著降低（P〈0.01）。结论化瘀祛痰方稳定动脉粥样硬化脂质斑块,其机制可能与调控HIF-1α/VEGF/VEGFR-2通路抑制血管新生有关。

玉米油高脂血症大鼠模型的建立

目的：建立一种可操作性、重复性好的高脂血症大鼠动物模型。方法：采用高脂饲料（玉米油10％、蔗糖5％、85％基础饲料）喂养SD大鼠三周，复制高脂血症动物模型。结果：模型组血清TC（总胆固醇）、TC（甘油三酯）、LDL—C（低密度脂蛋白胆固醇）显著升高，HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇）显著降低。结论：通过高脂饲料喂养SD大鼠可成功复制高脂血症动物模型。

丹酚酸B对EPCs释放VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9细胞因子及EPCs黏附能力的影响

目的研究丹酚酸B对血管内皮祖细胞黏附和旁分泌功能的影响。方法从健康人的外周血中分离培养血管内皮祖细胞,鉴定后将其分为对照组(不含丹酚酸B体),20、40、60μg/mL丹酚酸B组,分组后细胞培养48 h,CCK8试剂盒检测血管内皮祖细胞的增殖情况;流动腔实验检测血管内皮祖细胞黏附数量;酶联免疫吸附法检测培养基中细胞因子VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9的浓度。结果体外培养7 d后检测血管内皮祖细胞表面标志物CD34、CD45和VEGRF-2,其中内皮祖细胞比例为89.11%±6.09%;不同浓度丹酚酸B组血管内皮祖细胞培养2 d后,细胞增殖比例与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);流动腔实验结果显示,20、40、60μg/mL丹酚酸B组每个低倍镜视野的细胞计数分别为235±24、393±28和551±35,与对照组(98±13)比较差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度丹酚酸B培养4 d后,不同浓度丹酚酸B组培养基中VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9浓度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论丹酚酸B可以促进血管内皮祖细胞增殖,增强内皮祖细胞的黏附功能,还可以通过旁分泌途径释放VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9。

人参二醇对APP-SH-SY5Y细胞中Tau蛋白磷酸化及Fyn/GluN2B信号通路的影响

目的:研究人参二醇(PD)对转染APP基因的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(APP-SH-SY5Y)中Tau蛋白磷酸化的影响及其作用机制。方法:采用分子对接技术验证PD与非受体酪氨酸激酶Fyn的靶向性。在体外培养SH-SY5Y细胞,构建APP-SH-SY5Y细胞模型和绿色荧光蛋白(GFP)-SH-SY5Y细胞模型(对照细胞),通过检测细胞中β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的表达来验证APP-SH-SY5Y细胞模型是否构建成功。以GFP-SH-SY5Y细胞为对照,采用CCK-8法检测5、10、20、30、40μmol/L的PD和125、250、500、1000、2000 nmol/L的PP2(Fyn抑制剂,阳性对照)作用24 h对APP-SH-SY5Y细胞存活率的影响,以确定最佳给药浓度。以APP-SH-SY5Y细胞为对象,分别检测最佳浓度PD、PP2作用24后细胞中Ca2+浓度及磷酸化Tau蛋白(p-Tau)/Tau、磷酸化非受体酪氨酸激酶Src(p-Src)/Fyn、磷酸化谷氨酸受体2B(p-GluN2B)/GluN2B比值。结果:分子模拟对接结果显示,PD可靶向结合Fyn蛋白。与GFP-SH-SY5Y细胞比较,APP-SH-SY5Y细胞中Aβ1-42蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。PD和PP2的最佳作用浓度分别为20μmol/L和500 nmol/L。20μmol/L PD、500 nmol/L PP2均可显著升高细胞的存活率,显著降低细胞中Ca2+浓度以及p-Tau/Tau、p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B比值。结论:PD可通过抑制Fyn/GluN2B信号通路来降低APP-SH-SY5Y细胞中Ca2+浓度及Tau蛋白的磷酸化水平。

流感病毒先天免疫应答和先天免疫逃逸的机制

流感病毒引起人类和动物的呼吸道感染已是全世界严重的经济和公共卫生问题。在感染早期,流感病毒会导致机体的先天免疫信号被激活,起到防御、清除病毒以及辅助适应性免疫应答的作用。但在与宿主共进化的过程中,流感病毒形成了多种逃逸策略,主要是通过病毒自身蛋白质阻断宿主天然免疫通路,抑制干扰素和炎性因子的生成。基于现有的研究成果,本文针对流感病毒先天免疫应答和先天免疫逃逸的机制做一扼要综述,这有助于加强流感病毒抗原进化的监测、探索疫苗和抗病毒药物的合理靶标,为更好地预防和控制该病提供有效的策略。

冬凌草甲素对人脑胶质瘤细胞株U251杀伤、增殖及NF-κB蛋白表达的影响

目的观察冬凌草甲素对人脑胶质瘤细胞株U251杀伤、增殖及NF-κB蛋白表达的影响。方法将浓度为10、20、40、80μmol/L冬凌草甲素与U251细胞(实验组)分别孵育,同时设不加冬凌草甲素培养的U251细胞作对照组,分别于不同时间点计数U251、计算冬凌草甲素对U251细胞的IC50、测算U251细胞增殖抑制率、检测U251细胞中的NF-κB蛋白。结果与对照组相比,实验组加入40、80μmol/L的冬凌草甲素后U251细胞数明显减少(P均<0.05)。冬凌草甲素作用24、48、72 h时对U251细胞的IC50分别为82.2、65.3、44.1μmol/L。与20μmol/L冬凌草甲素相比,40、80μmol/L冬凌草甲素作用48、72 h时的细胞增殖抑制率明显降低(P均<0.05)。与对照组相比,40、80μmol/L的冬凌草甲素作用48、72 h时,U251细胞中NF-κB蛋白的相对表达量明显降低(P均<0.05)。结论冬凌草甲素在体外可杀伤人脑胶质瘤细胞株U251,抑制其增殖,下调其NF-κB蛋白的表达;冬凌草甲素对U251细胞的杀伤、增殖抑制作用可与其对NF-κB信号通路发挥调节作用有关。

H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的,笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后,病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点,为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对,确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物,构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量(EID50)。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数(MOI)为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞,测定病毒的体外复制能力;将上述各株病毒以50μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠,分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器,匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况;将病毒分别以50μL含101-106 EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠,感染后每天称量小鼠体重,当小鼠体重下降比率超过25%时判定为死亡,统计死亡情况,测定病毒的小鼠半数致死量(MLD_(50)),评估各突变病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒进行分析比较后,获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点,分别为4、138、144和225位(H3 Numbering)。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认,分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况,结果发现与亲本病毒rZD71相比较,突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后,复制滴度均显著提高;与rSY130相比较,突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后,复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒rZD71相比,225位氨基酸由G突变为E后,病毒rZD71-HA/G225E的MLD_(50)由4.32 log_(10)EID_(50)降低至3.0 log_(10)EID_(50);病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到,而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用,提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况,为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。

化瘀祛痰方对急性心肌缺血大鼠心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA表达的影响

【目的】观察化瘀祛痰方对急性心肌缺血大鼠心肌组织RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)信号通路中RhoA、ROCK1 mRNA表达的影响,探讨其防治机制。【方法】将60只SPF级雄性SD大鼠随机分为6组,即空白组,模型组,西药组,中药低、中、高剂量组,每组10只。西药组予以单硝酸异山梨酯水溶液(剂量为3.125 mg·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,中药低、中、高剂量组予以化瘀祛痰方水煎液(剂量分别为10.4、20.8、41.6 g·kg^(-1)·d^(-1))灌胃,空白组和模型组予以等体积生理盐水灌胃,给药7 d。预灌胃7 d后,除正常组外,其余各组大鼠给予腹腔注射异丙肾上腺素(Iso)复制急性心肌缺血模型。观测大鼠心电图ST段总偏移值。采用苏木素—伊红(HE)染色法观察大鼠心肌组织结构,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清内皮素1(ET-1)含量,qPCR法检测心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA的表达。【结果】与空白组比较,模型组心肌纤维大片断裂,间质出现明显出血,心电图ST段偏移值、血清ET-1含量、心肌组织RhoA与ROCK1 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组心肌纤维断裂情况改善,间质出血减少,心电图ST段偏移值、血清ET-1含量、心肌组织RhoA与ROCK1的mRNA表达水平均降低(P<0.05)。【结论】化瘀祛痰方可改善心肌缺血状态,其机制可能与降低心肌组织RhoA、ROCK1 mRNA表达,从而抑制心肌收缩,改善心肌血流量有关。

兔羊膜间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

为寻找兽医领域新的干细胞来源,以兔羊膜组织为材料,使用胰蛋白酶对羊膜组织进行消化去除上皮细胞,再使用Ⅰ型胶原酶消化分离培养得到兔羊膜间充干细胞(rabbit amniotic mesenchymal stem cells, rAMSCs)。观察细胞形态和生长规律并绘制出生长良好的P3及P10代rAMSCs生长曲线。经对比发现,P3代生长优于P10代,所以选择P3代进行冻存,探索P3代rAMSCs的冻存及复苏能力。通过免疫荧光鉴定相关干细胞标志蛋白的表达;通过流式细胞术对rAMSCs的细胞表型进行鉴定;通过体外诱导分化鉴定rAMSCs的诱导分化潜能。结果表明:P3代rAMSCs形态为长梭形,增殖性能好,冻存后复苏率高。P3代rAMSCs能够成功表达干细胞标志蛋白OCT4、SOX2和NANOG,低表达细胞表型蛋白CD34、CD45和HLA-DR,高表达细胞表型蛋白CD29、CD49d和CD73,符合MSCs鉴定标准,并在体外诱导条件下能够分化为成脂细胞和成骨细胞。说明酶消化法能够成功获取rAMSCs,并且生物学特性稳定,表达干细胞相关蛋白及表型,具有诱导分化潜能。