磷酸化丝／苏氨酸蛋白激酶B在小鼠过敏性气道反应肺组织炎性细胞中的差异表达

目的：探讨丝／苏氨酸蛋白激酶B（Akt）在过敏性小鼠肺组织不同炎性细胞中的活化状况。方法：应用卵蛋白致敏激发BALB／c小鼠制备过敏性气道炎症反应模型，抽取肺泡灌洗液（BALF）进行细胞总数计数和不同炎性细胞分类计数，应用免疫组织化学检测磷酸化Akt（p-Akt）在过敏性小鼠肺组织中不同炎性细胞的表达。结果：过敏性小鼠BALF中总细胞数明显高于正常鼠；分类细胞计数中，正常组以巨噬细胞为主，而过敏性小鼠的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞百分比明显升高；免疫组织化学显示p-Akt在过敏性小鼠气道中嗜酸性粒细胞中表达明显高于淋巴细胞和巨噬细胞，而在淋巴细胞中表达明显高于巨噬细胞。结论：Akt在过敏性小鼠的气道炎症中的作用与炎性细胞的种类密切相关，发挥不同的诱导嗜酸性粒细胞和巨噬细胞增多、趋化、释放炎性细胞因子和对抗淋巴细胞凋亡等重要的作用。

人脐血基质细胞的体外培养及向成骨细胞诱导分化

背景:研究证实婴儿脐带血里含有类似骨髓间充质细胞的细胞,但在培养过程中其成功率很低且难度高。目的:拟在体外分离培养人脐血基质细胞,并观察其分化潜能。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/2008-06在辽宁医学院中心实验室完成。材料:健康足月新生儿脐带血12份,每份30～60mL,由锦州市妇婴医院提供。方法:取采集的脐带血,使用淋巴细胞分离液离心后取界面上的白色混浊状细胞层,加入含体积分数为10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、0.3g/LL-谷胺酰胺、100U/mL青霉素和100g/L链霉素的L-DMEM培养液悬浮细胞,按2×109L-1密度接种于25cm2培养瓶中,待细胞达70%汇合时消化传代。取处于对数生长期的脐血基质细胞,将其培养基更换为含有地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基成骨诱导21～30d。主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态学特征,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,碱性磷酸酶染色和Von-Kossa染色检测成骨能力。结果:原代培养的人脐血基质细胞呈长梭形,需21～30d长满瓶底,传代后细胞增殖缓慢并逐渐死亡,细胞平均倍增时间为42h,处于G0/G1期的细胞达(86.54±2.31)%。在成骨诱导培养基里,脐血基质细胞增殖速度减慢,细胞形态无明显变化,成骨诱导14d后碱性磷酸酶阳性率为(46.0±2.1)%,成骨诱导21d形成钙化结节。结论:应用体积分数为10%胎牛血清、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子的L-DMEM培养液可在体外成功分离培养出人脐血基质细胞,但细胞增殖能力有限,诱导后可向成骨细胞方向分化。

pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体的构建及体外表达

目的构建毕氏酵母表达载体pPIC9K/Ang-1,并进行体外表达研究。方法从PGEM-T/Ang-1载体中切取目的片段Ang-1,利用定向克隆到毕氏酵母表达载体pPIC9K中,测序正确后,pPIC9K/Ang-1载体经SalⅠ酶切线形化,以电转化法导入GS115毕氏酵母菌株中,经YPD平板G418抗性筛选后获得Ang-1表达阳性菌株;用SDS-PAGE测定其分子量,用Western Blotting检测发酵上清中Ang-1的抗原性和表达量。结果成功切取1.5 kb的Ang-1片段,成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,Blast序列分析与GenBank中AY121504一致。酶切线性化的质粒成功转入GS115毕氏酵母中,诱导表达后SDS-PAGE显示重组人Ang-1分子量约66 kD,Western Blotting证实为人Ang-1。结论成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,成功获得稳定分泌Ang-1重组蛋白的基因工程菌株。

人血管生成素1真核表达载体的构建

目的构建人血管生成素1(angiogenin-1,ang-1)的真核表达载体。方法提取人总RNA,RT-PCR特异扩增人的Ang-1cDNA,与pGEM-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α。筛选表达蓝白斑的阳性菌株扩增,提取质粒。选择正确的序列的产物,Xho I、BamH I双酶切产物和质粒,T4DNA连接酶连接,PCR扩增后转化大肠杆菌,抽提质粒进行测序。结果测序结果显示基因序列与人血管生成素1序列完全一致。结论成功构建了pEGFP/Ang-1真核表达载体。

“肺俞”穴对支气管哮喘肺组织中白细胞介素-1β和白细胞介素-6的影响

目的探讨手动"肺俞"单穴对支气管哮喘肺组织中白细胞介素-1β和6的影响。方法Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、"肺俞"穴组以及非经非穴组,每组10只。卵蛋白(OVA)制敏、诱导建立哮喘大鼠模型,苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠肺组织病理改变、采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠肺组织匀浆上清白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)含量。结果针刺"肺俞"穴能够减轻支气管哮喘模型的炎性病理变化,减轻气道增厚,炎性细胞集聚,与非经穴相比具有明显差别。针刺"肺俞"穴可以下调支气管哮喘中升高的IL-1β含量(P=0.009),但是手动针刺"肺俞"单穴并不能明显下调支气管哮喘中升高的IL-6含量(P>0.05)。结论手动针刺"肺俞"单穴对支气管哮喘发病的调节作用可能与下调IL-1β表达水平相关。

“肺俞”穴对支气管哮喘大鼠血清促肾上腺皮质激素的影响

目的探讨手动单穴"肺俞"穴对支气管哮喘血清促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)的影响。方法 Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型组、"肺俞"穴组以及非经非穴组,每组20只。卵蛋白(OVA)制敏、诱导建立哮喘大鼠模型,用细胞计数板计算支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数,Wright Giemsa染色后分类细胞计数,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清ACTH的含量。结果针刺"肺俞"穴能减轻支气管哮喘模型的炎性细胞数量(P<0.05),并与非经穴相比具有明显差别(P<0.05)。哮喘大鼠血清ACTH含量降低(P<0.05),然而针刺"肺俞"穴并不能上调支气管哮喘中下降的ACTH含量(P>0.05)。结论手动针刺单穴"肺俞"穴对缓解哮喘咳嗽及消炎作用具有基础理论支持,但是其缓解炎症的途径不经过内分泌ACTH,是否具有缓解"气喘"的功能及机制还得进一步研究。