L6细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型

背景:在胰岛素抵抗的细胞模型中,以游离脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞和高胰岛素诱导的HepG2肝癌细胞最为常见,对分布最为广泛靶组织骨骼肌的胰岛素抵抗模型报道较少。目的:拟使用L6细胞株建立胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-05在辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室完成。材料:L6细胞株由中国协和医科大学细胞中心提供。α-MEM培养基为美国Gibco公司产品。方法:复苏后的L6细胞置于α-MEM培养基中诱导培养14d,以考马斯亮蓝染色观察肌管出现来确定L6成肌细胞株分化完成。将分化后的细胞建立胰岛素抵抗模型,按1×106/孔接种于24孔板内,用含体积分数为0.02胎牛血清的α-MEM培养,以L6细胞贴满24孔板的板底为宜。换液后,向各孔内分别加入含体积分数为0.02牛血清白蛋白的α-MEM无血清培养基饥饿培养5h。设立2组,实验组的板孔内加入含1×10-7mol/L胰岛素的HEPES缓冲液(136mmol/LNaCl,4.7mmol/LKCl,1.25mmol/LMgSO4,1.2mmol/LCaCl2,0.2%牛血清白蛋白,20mmol/LHEPES,pH7.4)孵育1h;对照组的板孔内加入不含胰岛素的HEPES缓冲液孵育1h。弃上清后用HBS缓冲液冲洗,每孔内分别加入含0.1mol/L葡萄糖的HBS缓冲液100μL,孵育10min后取出置于冰板上快速回收上清。主要观察指标:考马斯亮蓝染色观察L6细胞出现肌管结构情况,葡萄糖氧化酶法检测上清中葡萄糖浓度。结果:诱导前L6细胞未见肌性结构出现,诱导分化后L6细胞内出现肌管结构。使用α-MEM无血清培养基饥饿培养1,3h,两组上清中葡萄糖浓度基本相似(P>0.05);使用α-MEM无血清培养基饥饿培养5h后,实验组上清中葡萄糖浓度明显高于对照组(P<0.05)。结论:诱导分化成肌后的L6骨骼肌细胞经α-MEM无血清培养基饥饿培养5h,在胰岛素浓度为1×10-7mol/L的刺激下可形成胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。

小檗碱对2型糖尿病大鼠肾小管的影响

目的:研究小檗碱(Berberine,BBR)对2型糖尿病(Type2diabetesmellitus,T2DM)大鼠肾小管的影响,并分析其意义。方法:将30只清洁级雄性SD大鼠高脂高糖喂养8周后随机均分为3组,其中2组通过尾静脉注射链脲佐菌素(Strepto-zotocin,STZ)的方法制成T2DM模型,再分别给予BBR和阿司匹林灌胃;另一组为对照组(CON组),尾静脉注射柠檬酸缓冲液再给予等剂量的阿司匹林灌胃。定期检测血糖、血脂和胰岛素水平,用免疫荧光染色和高碘酸-希夫反应分别检测BBR干预后葡萄糖转运蛋白4(Glucose transporter 4,GLUT4)在肾组织的表达和肾小管的病理变化。结果:BBR干预的T2DM大鼠肾组织GLUT4表达较模型组显著增加;肾小管上皮细胞肿胀和细胞内糖原颗粒积聚的程度较模型组明显轻。结论:BBR可延缓T2DM大鼠肾小管的病理变化进程,其机制可能与提高肾小管GLUT4的表达水平有关。

盐酸小檗碱对2型糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用

目的探讨盐酸小檗碱对2型糖尿病大鼠心肌损伤的保护作用。方法选择健康雄性SD大鼠60只,随机分为CON组、T2DM组、BBR组和MET组,每组15只。CON组给予清洁级饲料喂养。其余3组均给予高脂、高糖饲料喂养8周后测量大鼠的体质量和空腹12 h血糖水平,尾静脉注射预冷的链脲佐菌素25 mg/kg。72 h后将非空腹血糖浓度大于11.1 mmol/L者视为2型糖尿病诱导成功;CON组和T2DM组用0.9%NaCl 2 mL灌胃;BBR组用BBR 100 mg/kg灌胃;MET组用二甲双胍50 mg/kg灌胃。分别检测心肌糖类物质的变化和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)在心肌的表达。结果 BBR组大鼠心肌细胞内糖原颗粒积聚和心肌细胞病理变化的程度较T2DM组和MET组明显减轻,GLUT4表达较T2DM组和MET组显著增强(P<0.05)。结论小檗碱可延缓2型糖尿病大鼠心肌细胞病理变化的进程,其机制可能与提高心肌细胞GLUT4的表达水平有关。

胰岛素产生细胞的诱导分化及微囊对其分泌能力的影响

目的探讨微囊对胰岛素产生细胞(insulin-producing cells,IPCs)分泌能力的影响。方法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)并传代纯化,应用大鼠胰腺提取物(rat pancreatic extract,RPE)对其进行诱导分化,诱导后的细胞随机分为微囊化组和未微囊化组。分别在1、2、3、4、5周等不同时间点,通过葡萄糖刺激实验,检测细胞的胰岛素与C肽释放情况。结果葡萄糖刺激实验结果显示,1周时微囊化IPCs与未微囊化的IPCs均能释放胰岛素,其量没有显著的差别;培养2周后未微囊化的IPCs胰岛素和C肽释放量开始下降,而微囊化IPCs胰岛素与C肽释放量在培养4周后才开始逐渐下降。结论微囊可延长IPCs的作用时间,有利于IPCs作用的发挥。

DAPT对人胶质瘤细胞系SHG-44增殖的抑制作用及机制

目的探讨γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对人脑胶质瘤细胞系SHG-44细胞体外增殖的抑制作用及机制。方法应用不同浓度的DAPT作用SHG-44细胞,采用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期及CD133+的肿瘤干细胞(TSC)数量的变化;应用RT-PCR及Western印迹法检测Notch通路关键分子(Notch-1,Delta-l,Hes-1)基因及蛋白水平的表达。结果 DAPT作用SHG-44细胞后,明显抑制了细胞增殖(P<0.05),且抑制作用呈剂量依赖性。细胞周期结果显示S期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例显著增加;CD133+的TSC数量明显减少。随着DAPT浓度的增加,Notch-1,Delta-l,Hes-1 mRNA及蛋白表达水平逐渐下降。结论 DAPT可以下调Notch通路中Notch-l、Delta-1、Hes-1的表达,减少TSC数量,抑制SHG-44细胞增殖。

阿魏酸钠抑制Aβ_(25-35)激活小鼠巨噬细胞引起的神经细胞损伤

目的探讨阿魏酸钠(SF)抑制淀粉样β蛋白(Aβ25-35)激活巨噬细胞引起的神经细胞损伤及其机制。方法单独培养小鼠腹腔巨噬细胞以及与神经细胞联合培养,加入10μmol/L的Aβ25-35,保护组加入不同浓度的SF。单独培养的巨噬细胞,采用Western blot和ELISA法分析P38 MAPK水平和检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生成量。神经细胞和巨噬细胞联合培养,采用免疫组织化学方法和LDH检测试剂盒检测微管相关蛋白2(MAP-2)的表达水平和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量。结果SF能显著降低Aβ25-35诱导的腹腔巨噬细胞核蛋白P38 MAPK的含量及细胞的TNF-α水平,能显著地降低LDH漏出量,使MAP-2表达水平明显增加,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论SF可抑制Aβ25-35诱导的P38 MAPK通路,使TNF-α水平降低,对神经细胞具有保护作用。

糖皮质激素对糖尿病大鼠视网膜病变的影响

目的:探讨糖皮质激素对糖尿病(diabetes mellitu,DM)大鼠视网膜神经组织的损伤作用及机制。方法:利用链脲佐菌素诱导大鼠DM模型,玻璃体内注射腺病毒(DM组)或腺病毒包装的糖皮质激素受体反义寡核苷酸(si GR组)、阴性核苷酸序列(scRNA组)。另取正常SD大鼠,玻璃体腔注射腺病毒为对照组(CON组)。12wk后,HE染色检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)密度,测量大鼠视网膜厚度,免疫组织化学和Western-blot检测ROCK表达变化。结果:与CON组相比,DM组、si GR组及scRNA组糖皮质激素浓度均明显升高(均P<0.01)。HE染色显示,与CON组相比,DM组及scRNA组RGC密度明显降低,视网膜厚度下降,ROCK的蛋白表达增加(均P<0.01),而si GR组无明显变化(均P>0.05)。结论:抑制糖皮质激素能下调糖尿病大鼠视网膜ROCK表达,恢复视网膜RGC密度降低及视网膜厚度。

不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞生物学特性的研究

目的观察不同年龄段大鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)生物学特点与年龄的关系,为临床寻找理想的种子细胞并迅速获取所需ADSCs提供实验依据。方法使用密度梯度离心法分离不同年龄段脂肪间充质干细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,分析脂肪间充质干细胞的纯度,观察细胞生长情况,检测其增殖活性、细胞周期。结果不同年龄段ADSCs均贴壁生长,呈典型ADSCs形态和生长特征,传代细胞的增殖速度比原代细胞快,但随着年龄的增长,原代及传代培养ADSCs的增殖能力下降,生长周期延长。结论ADSCs的增殖能力和活性随着年龄的增长而降低,但各年龄段ADSCs均可满足临床不同患者组织工程种子细胞的要求。