大鼠肌源性干细胞体外转分化为胰岛素分泌细胞

目的探讨体外自体肌源性干细胞（MDSCs）定向诱导分化为胰岛素分泌细胞团的可行性。方法用差速贴壁的方法对SD大鼠MDSCs进行分离和培养,加入联合诱导剂培养7-12 d。通过形态学观察、双硫腙（DTZ）染色、免疫细胞化学染色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR,对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定。结果联合诱导后12 d有典型的胰岛样结构出现;诱导后第12天细胞团表达胰岛素,而未诱导组细胞不表达;诱导后第7天检测到胰岛素（INS）、胰高血糖素（GLU）和生长抑素（SS）基因的表达。结论体外诱导大鼠肌源性干细胞可定向分化为胰岛素分泌细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径。

内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨内质网应激在高糖诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用。方法采用混合酶一步消化法分离SD大鼠乳鼠心肌细胞,以高糖诱导的心肌细胞为模型,将培养的心肌细胞分为3组,甘露醇对照组(对照组)、高糖(25 mmol/L)组和高糖加抗氧化剂组(NAC组),分别检测各组心肌细胞中活性氧(ROS)的含量,利用RT-PCR法检测心肌细胞中内质网应激标志分子GRP78、CHOP和Caspase-12的表达情况。结果与对照组比较,高糖组心肌细胞中ROS含量明显增多,细胞凋亡率升高(P<0.01),与高糖组比较,NAC组ROS含量减少(P<0.01),细胞凋亡率降低(P<0.01);与NAC组比较,高糖组内质网应激标志分子的mRNA表达显著上调(P<0.01),抗氧化剂能阻断高糖心肌细胞中内质网应激标志分子mRNA的表达,使其表达明显下调(P<0.01)。结论内质网应激凋亡通路可能参与高糖诱导的心肌细胞凋亡。

P53在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨P53在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为4组:对照组、P53抑制剂组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L,P53抑制剂浓度为50μmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)和高糖+P53抑制剂组(P53抑制剂浓度为50μmol/L)。噻唑盐比色法(MTT法)检测心肌细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot对各组细胞P53、BAX和Caspase-3进行半定量分析。结果与对照组相比,高糖组心肌细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多。与P53抑制剂组相比,高糖组心肌细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多;高糖+P53抑制剂组心肌细胞活力也有所降低,凋亡率升高,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达增多。与高糖组相比,高糖+P53抑制剂组的心肌细胞活力增高,凋亡率明显降低,Caspase-3、BAX和线粒体蛋白P53表达减少。结论高糖可能通过介导P53转位到线粒体激活凋亡通路,引起心肌细胞凋亡。

氧化应激和内质网应激在高糖诱导大鼠心肌细胞凋亡中的关系

目的探讨活性氧(ROS)介导的氧化应激(OS)与内质网应激(ERS)在高糖诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用关系。方法采用混合酶一步消化法分离SD大鼠乳鼠心肌细胞,将培养的心肌细胞分为3组,对照组、高糖组和抗氧化剂组,流式细胞术检测细胞凋亡,分别检测各组心肌细胞中ROS的含量和上清液中超氧化物歧化酶(SOD)的含量,以反映心肌细胞的OS水平,再利用免疫组化法和RT-PCR检测心肌细胞中内质网应激标志因子Caspase-12的表达情况。结果与对照组相比,高糖组心肌细胞中ROS含量明显增多(P<0.01);SOD含量显著下降(P<0.01);与高糖组相比,抗氧化剂组ROS含量明显降低(P<0.01),抗氧化剂组较高糖组ROS含量明显降低(P<0.01),SOD含量升高(P<0.05);免疫组化法检和RT-PCR测心肌细胞中内质网应激标志因子Caspase-12检测结果显示,高糖组明显大于对照组,抗氧化剂组与高糖组比较表达显著下调(P<0.01)。结论高糖诱导的心肌细胞凋亡中,ROS启动的OS和ERS可能共同参与了心肌细胞凋亡过程。

核因子-κB和caspase-3在高糖诱导的心肌细胞代谢记忆中的表达

目的探讨核因子-κB(NF-κB)和caspase-3在高糖诱导的心肌细胞代谢记忆中的表达作用。方法原代培养乳鼠心肌细胞,随机分为4组:持续低糖组、持续高糖组、代谢记忆组、NF-κB特异抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐组(PDTC组)。采用TUNEL检测细胞凋亡指数,免疫组化检测核内NF-κB的表达,Westernblot检测caspase-3蛋白表达。结果 TUNEL染色结果:代谢记忆组和持续高糖组中平均每视野心肌细胞凋亡指数均较持续低糖组的显著升高(P<0.01),PDTC组中平均每视野心肌细胞凋亡指数明显低于代谢记忆组(P<0.05)。代谢记忆组和持续高糖组中的NF-κB核内蛋白水平均较持续低糖组的显著升高(P<0.01),PDTC组中的NF-κB核内蛋白水平明显低于代谢记忆组(P<0.05)。代谢记忆组和持续高糖组中的caspase-3的表达较持续低糖组有明显的增加(P<0.01),而PDTC组较代谢记忆组caspase-3的表达有明显降低(P<0.01)。结论 PDTC能抑制代谢记忆中所致的心肌细胞的损伤,NF-κB的激活可能导致caspase-3的活性增加,从而介导了高糖诱导的代谢记忆所致的心肌细胞的凋亡。

NF-κB在高糖诱导“代谢记忆”致心肌细胞损伤的作用机制

目的探讨代谢记忆损伤心肌细胞的分子机制。方法体外培养20只SD大鼠乳鼠心肌细胞,每组5只,分为4组:持续低糖组、持续高糖组、代谢记忆组和PDTC组。计算细胞凋亡指数,免疫组化检测核内NF-κB的表达,Western Blot检测NF-κB蛋白,TUNEL检测细胞凋亡。结果代谢记忆组蛋白表达水平(15.12±2.32)和持续高糖组的(17.10±3.12)均较持续低糖组(5.23±2.13)的NF-κB核内蛋白水平显著升高(P<0.01),PDTC预处理后,NF-κB核内蛋白水平(7.12±2.41)较代谢记忆组(17.10±3.12)显著降低(P<0.05);同时,代谢记忆组(19.42±3.22)和持续高糖组(22.36±3.45)凋亡指数较持续低糖组(8.56±0.23)有明显的增加(P<0.05),而PDTC组(10.33±1.34)较代谢记忆组心肌细胞凋亡指数(19.42±3.22)有明显降低(P<0.05)。结论 PDTC能抑制代谢记忆中所致的心肌细胞的损伤,NF-κB的激活可能介导了高糖诱导的代谢记忆所致的心肌细胞的损伤。

与肌源性干细胞共培养改善大鼠胰岛活性

目的研究体外共培养模型中肌源性干细胞(MDSCs)改善大鼠胰岛活性的作用。方法提取新生大鼠MDSCs原代细胞,差速贴壁培养后行结蛋白免疫细胞化学鉴定,取第4代MDSCs接种在transwell底板。提取大鼠胰岛后,双硫腙染色鉴定,胰岛在高糖环境中处理24 h后放入tran-swell板上层与MDSCs共培养。在培养的第1、3、6天分别用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色胰岛,RT-PCR检测胰岛的Bcl-2/Bax基因表达来评价胰岛凋亡,其结果与单独胰岛培养组比较。结果与单独胰岛培养相比,共培养组第3、6天AO/EB染色见胰岛细胞明显增多,Bcl-2明显升高,而Bax明显降低(P<0.05、P<0.01)。结论大鼠胰岛与MDSCs共培养延长大鼠胰岛存活时间,改善胰岛活性。