医学硕士研究生免疫组织化学PBL教学模式改革探索

"免疫组织化学"是医学硕士研究生前期学习的一门主要学科,为了提高教学质量,深化教学改革,我们先后在辽宁医学院2008级、2009级和2010级三个年级的硕士研究生中开展了PBL模式的免疫组织化学教学改革,对教学内容、教学方法和考试方式等都做了创新性的改革。经问卷调查,学生对本门课程的改革非常认可,教学效果良好。PBL模式的免疫组织化学教学大大提高了学生的创新能力和操作能力,为今后的科研工作打下了良好的基础。

Calbindin-D28k在胚胎期小鼠肾组织的表达

目的观察Calbindin-D28k在胚胎发育不同时期小鼠肾组织中的表达规律,探讨Calbindin-D28k在胚胎小鼠肾发育中的作用。方法应用免疫荧光技术及蛋白印迹技术(Western blotting)对胚龄10、12、14、16、18 d小鼠肾组织中Calbindin-D28k的表达进行定性观察和半定量分析。结果Calbindin-D28k在胚龄12 d胎鼠肾输尿管芽开始微弱表达,之后随胚龄增加其表达量逐渐增加。胚龄12 d在输尿管芽表达;胚龄14 d在输尿管芽Y型分支表达;胚龄16 d在输尿管芽壶腹表达,且在S小体与输尿管芽壶腹连接处有少量表达;胚龄18 d定位于连接小管、皮质集合管上皮细胞胞浆内。结论推测Calbindin-D28k可能对胚胎小鼠肾集合管系的发育有一定作用。

小鼠胚胎肾脏细胞坏死性凋亡的超微结构

目的观察小鼠胚胎肾脏发育过程中细胞坏死性凋亡的超微结构变化。方法应用电子显微镜技术对不同胚龄(E12、14、16、18d)胎鼠(各3例)的肾脏的细胞坏死性凋亡进行系统观察。结果细胞坏死性凋亡确实出现在胚胎肾脏中,它同时具有坏死的细胞质和凋亡的细胞核。细胞肿胀,细胞膜破溃,细胞器也肿胀空泡化。核染色质高密度固缩,边聚,多呈月牙状。细胞凋亡被发现的机会大于坏死性凋亡和细胞胀亡。结论细胞坏死性凋亡与细胞凋亡及细胞胀亡共同构成了小鼠胚胎肾脏发育过程中的程序性细胞死亡,但坏死性凋亡和胀亡为辅,而以细胞凋亡为主。

小鼠胚胎肾细胞凋亡与胀亡的超微结构

目的：观察小鼠胚胎肾发育中细胞凋亡与胀亡的超微结构。方法：应用透射电子显微镜对不同胚龄大鼠肾进行了系统观察。结果：作为细胞程序性死亡的胀亡出现在发育的。肾中，但与凋亡相比出现的频率不高。凋亡与胀亡的不同仅在于细胞质的表现。结论：在肾发育中细胞凋亡仍然为主要的程序性细胞死亡，胀亡只处于辅助地位。

Ⅳ型胶原在胚胎小鼠肾脏发育过程中的表达

目的观察Ⅳ型胶原在胚胎小鼠肾脏发育过程中的表达规律,为阐明Ⅳ型胶原在胚胎肾发育中的生物学功能提供理论依据。方法采用免疫组织化学方法结合体视学方法和western blot技术对不同胚龄小鼠肾组织中的Ⅳ型胶原的表达进行研究。结果胚龄12 d时,在输尿管芽周围没有Ⅳ型胶原的表达。胚龄14 d时,在逗号小体和S小体的基膜上开始出现Ⅳ型胶原的表达。随着肾脏的发育,Ⅳ型胶原表达于各期肾小体的基膜、肾小管基膜、和细胞间质。体视学测量和west-ern blot结果显示Ⅳ型胶原的表达量逐渐增加。结论在胚胎肾发育过程中,Ⅳ型胶原的分布具有一定的时空顺序。在时间上其随着肾脏发生发育增加,在空间上其表达于基膜存在的部位,可能对基膜的发生发育起一定的作用。

通心络对糖尿病小猪肾组织中TGF-β_1表达的影响

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)在糖尿病小猪肾组织中的表达及中药通心络对其表达的影响。方法以联合注射链尿佐菌素(STZ)与四氧嘧啶的方式复制糖尿病小猪模型,将动物随机分为糖尿病组(DM),通心络治疗组(TXL)和正常对照组(C)。6个月后处死动物,测量肾重/体重比值,应用免疫组化技术和western blotting技术观察肾组织中TGF-β1的表达。结果与对照组相比,糖尿病组小猪肾重/体重比值和TGF-β1的表达明显增加,通心络可显著降低肾重/体重比值和TGF-β1的表达。结论通心络通过影响糖尿病小猪肾组织中TGF-β1的表达改善糖尿病肾组织纤维化。

血管紧张素Ⅱ受体1在胚胎及生后小鼠肾的表达

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体1(AngiotensinⅡreceptor type1,AT1R)在小鼠早期肾脏发育中的表达及其与肾脏发育的关系。方法采用免疫组织化学方法和免疫印迹法(W estern b lot)检测胚龄14、15、16、18d及生后日龄1、3d小鼠肾脏发育中AT1R的表达。结果胚龄14 d,AT1R在输尿管芽中有少量表达,胚龄15 d时AT1R表达达到高峰,从胚龄16天开始AT1R在输尿管芽及其分支表达明显减弱,而较多出现在皮质肾小管,胚龄18 d时,只有微量表达。AT1R在小鼠后肾发生发育中的表达具有一定的时空顺序,最先出现在输尿管芽,然后是肾小管及肾小球。结论AT1R与输尿管芽分支不断延长以及肾小球和肾小管的增殖和分化密切相关。

胚胎小鼠肾脏发育过程中eNOS表达与细胞凋亡的关系

目的观察胚胎小鼠不同发育阶段肾组织中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达和细胞凋亡的特征,探讨eNOS与细胞凋亡的关系。方法应用原位末端标记(TUNEL)法检测胚胎小鼠肾组织中的细胞凋亡,免疫组织化学方法和体视学方法检测eNOS的表达。结果不同发育阶段的肾组织中均可见到TUNEL染色阳性的细胞,凋亡指数从E14d开始增高,E18d达到高峰。eNOS表达于皮质生肾区、近端小管和远端小管,表达量随着发育逐渐增加。结论细胞凋亡和eNOS的表达在小鼠肾脏胚胎发育过程中具有重要的作用,细胞凋亡与eNOS的表达有一定的相关性。

胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析

目的:探讨神经型一氧化氮合酶在胚胎小鼠妊娠不同时期肾脏发育中的意义。方法:选用成年健康昆明小白鼠,按雌雄比例3:1同窝饲养,采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。选取胚龄12天(ED12)、14天(ED14)、16天(ED16)、18天(ED18)的胎鼠及出生时(PD0)仔鼠,分5组,每组各6只母鼠,每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠,剖腹取肾脏,用免疫印迹技术(Westernblot)及光密度分析系统分别对各组胎鼠或仔鼠肾脏内nNOS进行定量检测。结果:Western blot及光密度分析显示,ED14组肾脏nNOS含量最少,随后逐渐增多,PD0组肾脏nNOS含量最多。结论:胚胎小鼠肾脏nNOS在胚胎第14天开始呈阳性表达,以后含量逐渐升高,出生时含量最高,表明nNOS在胚胎小鼠肾脏发育的早期阶段起重要作用。

内皮型一氧化氮合酶和神经型一氧化氮合酶在胚胎小鼠肾发育过程中的表达

目的：观察内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和神经型一氧化氮合酶（nNOS）在胚胎小鼠肾发育过程中的时空性表达，探讨它们在小鼠发育早期肾组织中的作用。方法：选取胚龄（E）13、14、15、16、18d及新生组（P）0d小鼠，应用免疫组织化学方法显色进行图像分析；用免疫印迹法测定各组小鼠肾组织中的eNOS以及nNOS的含量。结果：免疫组织化学显色显示，eNOS阳性表达最早出现于E14d的生肾区；E16d时在生肾区表达减弱，近端小管呈强阳性；P0d时远端小管可见弱表达，集合管也有一定程度表达，致密斑无表达。nNOS在E13d时即表达于皮质输尿管芽；E16d时近端小管弱表达，远端小管强表达；P0d时在远端小管和致密斑强表达，近端小管弱表达，集合管无表达。图像分析和免疫印迹法结果显示，eNOS和nNOS在E14d含量较少，随后逐渐增多，至P0d达到高峰。结论：在胚胎小鼠肾发育过程中，eNOS和nNOS的表达有一定的时空顺序，它们对肾组织的发育及形成起一定的作用。

小鼠胚胎肾程序性细胞死亡行为的超微结构变化

目的：观察小鼠胚胎肾发育过程中程序性细胞死亡行为的超微结构变化。方法：应用透射电子显微镜技术对不同胚龄（E12、14、16、18d）胎鼠的肾程序性细胞死亡进行系统观察。结果：在小鼠胚胎肾中，细胞凋亡多见，出现在肾发育的各个时期和各个结构中，程序性坏死和副凋亡少见，只出现在发育中的肾单位内。程序性细胞死亡的结局包括被吞噬、被血流带走和经尿液排出。结论：细胞凋亡、程序性坏死和副凋亡构成了小鼠胚胎肾发育过程中的程序性细胞死亡，以细胞凋亡为主，程序性坏死和副凋亡为辅。。肾发育过程中程序性死亡的细胞尸骸经尿液排出是一个与肾结构特征有关的处理方式。

胚胎小鼠肾发育过程中nNOS的表达

目的观察神经型一氧化氮合酶(nNOS)在胚胎小鼠肾发育过程中的表达,探讨nNOS在小鼠肾脏发育早期的作用。方法选取胚龄(E)12、14、16、18 d及新生组(P0 d)小鼠,应用免疫组织化学技术观察nNOS的表达部位。应用体视学检测体密度值方法和免疫印迹技术检测各组小鼠肾组织中nNOS含量。结果免疫组化染色显示,E12 d,nNOS在输尿管芽呈现阳性表达;E14 d,nNOS在皮质生肾区、近端小管和远端小管表达。E16 d,nNOS在输尿管芽、生肾区和近端小管的表达减弱,在远端小管的表达加强。至P0 d,nNOS在输尿管芽、生肾区和近端小管的表达进一步减弱,在远端小管尤其是致密斑处呈强表达。从E12 d至P0 d,除了在成熟肾小体的肾小囊偶见nNOS的阳性表达外,在发育各期的肾小体中均未见nNOS的阳性表达。在集合管中也无表达。体视学分析结果显示,从E12 d至P0 d,各组小鼠肾组织中nNOS的体密度值逐渐增加。免疫印迹结果显示,从E12 d至P0 d,nNOS的表达量逐渐增加。结论在胚胎小鼠肾发育过程中,nNOS表达部位主要在远端小管致密斑,可能对远端小管的发育起重要的调节作用。

TGF-β1在猪糖尿病心肌组织的表达及通心络的干预作用

目的观察通心络对糖尿病小猪心肌组织中转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响,探讨糖尿病心肌病的发病机制及通心络的保护作用。方法制备糖尿病小型猪模型,随机分为糖尿病心肌病组(DCM)和通心络治疗组(TXL),以正常小猪作为对照组(C)。检测各组小猪的血糖变化情况。观察通心络对糖尿病小猪血流动力学的影响。应用免疫组化技术和Western blot技术观察各组动物心肌组织中TGF-β1的表达。结果通心络对糖尿病小猪的血糖无明显影响,但是可明显增加糖尿病小猪心肌血流。与对照组相比,糖尿病组小猪心肌组织中TGF-β1的表达明显增加,通心络可显著降低TGF-β1的表达。结论通心络可改善糖尿病心肌组织的功能,可能通过降低TGF-β1表达这一途径改善心肌纤维化状态,对糖尿病心肌组织具有保护作用。

通心络对小鼠糖尿病肾组织microRNA192表达的影响

目的观察通心络对糖尿病小鼠肾功能及microRNA192表达的影响。方法以注射链尿佐菌素(streptozotocin,STZ)的方式诱导建立糖尿病小鼠模型,成模小鼠随机分为糖尿病组(DM)和通心络组(TXL),另设正常对照组(C)。动物饲养6个月,测量小鼠的肾重/体重比值,光镜观察肾脏的病理变化,实时荧光定量PCR检测各组小鼠肾组织中microRNA192的表达。结果通心络可降低糖尿病小鼠肾重/体重比值,减少肾组织中microRNA192的表达,减轻肾脏病理变化。结论通心络可能通过影响糖尿病小鼠肾组织中microRNA192信号通路改善糖尿病肾病症状。

T3对小鼠糖尿病肾组织中TGF-β_1表达的影响

目的观察T3对小鼠糖尿病肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响,探讨T3影响糖尿病肾组织纤维化的作用机制。方法 36只小鼠随机挑选12只为正常对照组(C),余24只以注射链尿佐菌素(STZ)方式复制糖尿病小鼠模型,分为糖尿病组(DM)和T3组(T3)。动物饲养6个月后取材肾组织,应用免疫组化技术、体视学方法(检测体密度)和Western blot技术观察各组肾组织中TGF-β1的表达。结果与对照组相比,糖尿病组小鼠TGF-β1的表达范围明显增加,T3组TGF-β1的表达范围明显低于糖尿病组。结论 T3通过降低TGF-β1影响糖尿病肾组织纤维化范围大小和进程。

整合素α_5在胚胎小鼠肾脏发育过程中的表达

目的观察细胞外基质的受体—整合素α5在胚胎小鼠肾脏发育过程中的时空性表达,探讨其在胚胎肾脏发育中的作用。方法采用免疫组织化学(酶组织化学和荧光组织化学)方法观察不同胚龄小鼠肾组织中整合素α5的表达,细胞图像分析技术检测阳性表达的灰度值,体视学技术检测阳性表达的体密度值。结果免疫组化结果显示:胚龄12 d时整合素α5在输尿管芽(UB)周围的生后肾组织有表达。胚龄14 d时整合素α5在生肾区有表达。胚龄16 d和18 d时整合素α5在发育各个阶段的肾小体、肾小管都有一定程度的表达。图像分析和体视学结果显示:整合素α5的表达随着肾脏发育逐渐增强。结论整合素α5在发育各个时期的肾小体、肾小管都有一定程度的表达,且随着肾脏的发育表达逐渐增多。提示整合素α5对肾小体、肾小管的发育都起一定的诱导作用。

形成性考核在组织与胚胎学教学中的应用

随着高等医学院校招生规模的不断扩大和进一步发展,高等教育已经由精英教育向大众化教育转变。如何培养出基础理论扎实,具有创新精神、实践能力及科研能力强和综合素质高的现代医学人才,是21世纪我国高等医学教育面临的艰巨任务[1]。为了提高高等医学院校的教学质量,增强学生学习的积极性,改变高分低能的局面,我校于2012年对组织与胚胎学的教学施行形成性考核。

胶原蛋白复合壳聚糖支架的制备及生物学性状:壳聚糖及胶原比例筛选

背景:壳聚糖和胶原类支架已成为组织工程常用的载体材料。但是,现阶段如何能够通过调节二者比例而达到理想的细胞载体仍是目前需要解决的问题之一。目的:调节胶原与壳聚糖二者配制比例制备支架材料,检测及对比不同比例支架材料生物学性质。方法:制备1∶1,1∶2,1∶3,1∶4,1∶5比例的壳聚糖、Ⅰ型胶原蛋白成分,经紫外线交联后冷冻干燥,再将其用NAOH与蒸馏水进行中和,二次冻干制备好支架。观察不同比例支架的材料性质、孔隙率、降解率、溶胀率;扫描电镜观察孔径的大小及形态。结果与结论:在壳聚糖含量固定,支架的大体孔径经统计比较差异有显著性意义(P<0.05)。1∶3比例制备的孔径最大,达到(298.0±36.0)μm;支架总体的孔隙率为93.9%～97.5%,胶原比例的增加对支架孔隙率的影响较轻微。各组支架的溶胀率可达到80%左右,支架的溶胀程度随胶原比例增加而减少。在支架的降解率随着胶原比例增加而增加,而壳聚糖含量越高,降解速度越慢。结果证实,通过紫外光交联法,按照1∶3配比的胶原和壳聚糖的支架材料更加适合软骨组织工程的要求。

尼克酰胺与胰腺损伤提取物诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞的比较

目的探讨诱导小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为胰岛素产生细胞较好的方法。方法大鼠胰腺提取物和尼克酰胺分别诱导小鼠的BMSCs分化,经免疫组织化学、双硫腙染色、放射免疫学方法和RT-PCR技术(Ins-1、Ins-2、Glut-2、GK)鉴定两种诱导方法诱导细胞的分化程度。结果两种方法诱导后的细胞均可以表达胰岛素。双硫腙染色和胰岛素免疫组织化学的染色结果发现,两种分化后的细胞无明显差异。放射免疫学检测胰岛素及C肽片段:两种分化后的细胞表达的胰岛素随25mmol/L葡萄糖刺激时间的延长产生的胰岛素分泌曲线有明显差别,尼克酰胺分化的小鼠BMSCs产生的胰岛素产生细胞(IPCs)与正常小鼠胰岛细胞的曲线一致性欠佳,而大鼠胰腺损伤提取物分化的小鼠骨髓间充质干细胞产生的胰岛素产生细胞的分泌曲线一致性很好。尼克酰胺分化后的细胞不能产生C肽片段,而大鼠胰腺损伤提取物能够表达C肽片段。RT-PCR结果显示,尼克酰胺与大鼠胰腺提取物均可以表达胰岛细胞相关的几个mRNA(Ins-1、Ins-2、Glut-2、GK)。结论大鼠胰腺提取物与尼克酰胺相比,可能是一种较好的诱导BMSCs分化成熟产生胰岛素的诱导剂。

水通道蛋白-1在小鼠肾小管发育中的表达

目的观察水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP-1)在小鼠肾小管发育过程中的时空性表达,探讨AQP-1与肾小管发育的关系。方法采用免疫组织化学技术结合体视学方法和免疫印迹法,测定不同胚龄(E)12、14、17、18d及生后日龄(P)1、3、7、14、24、40、70d小鼠肾小管内AQP-1的表达及其含量变化。结果免疫组织化学结果显示AQP-1在E14d髓质部位发育中的小管即有表达,之后主要表达在近端小管、髓袢降支细段的管腔膜和侧基底膜,生肾区则无阳性表达。图像分析和体视学测量显示随着胚龄的增加,AQP-1在肾小管表达逐渐增强后趋于稳定;免疫印迹法显示AQP-1在肾脏的表达量在P 7d达到高峰后趋于稳定。结论 AQP-1在肾小管的发育过程中存在时空性表达,对肾小管的发育和成熟起关键作用。