蛋白质组学技术在药物肝毒性研究中的应用

蛋白质组学技术的发展促进了许多学科的发展,毒理蛋白质组学(toxicoproteomics)整合了经典毒理学、病理学和蛋白质差异表达分析技术,使毒理学研究上升到了一个新的高度。药物性肝损伤是肝脏疾病的一个重要原因,也是药物开发所面临的一项重大挑战。现就蛋白质组学的主要技术,包括双向凝胶电泳-质谱(2-DE-MS)、液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)、保留色谱-质谱(RC-MS)和蛋白质阵列,以及其在药物肝毒性研究中的应用,包括毒性蛋白标志物的筛选、毒性机制研究、毒性预测与毒性蛋白质数据库的建立方面进行综述。

小牛血清去蛋白提取物活性物质理化性质的实验研究

目的研究小牛血清去蛋白提取物(deproteinated extract of calf blood,DECB)中生物活性物质的物理化学性质。方法分别将小牛血清去蛋白提取物进行加热、加酸、加碱、烘烤、有机溶剂萃取、接种微生物发酵等方法处理,然后分别用微量呼吸检压法检测呼吸活性。结果采用加热、加碱、加酸,接种微生物发酵的方法进行处理,DECB刺激呼吸活性的能力没有明显改变,而采用烘烤的方法处理,DECB的活性完全消失;用有机溶剂萃取DECB,可明显降低DECB刺激呼吸活性的能力,而有机相中含有了刺激呼吸活性物质。结论小牛血清去蛋白提取物(DECB)中刺激呼吸的活性物质耐高温、耐酸、耐碱,并且不易被普通微生物降解,但不耐烘烤,较易被有机溶剂萃取,由理化性质推测DECB中的活性物质可能是一种活性脂类。

Toll样受体4/NF-κB信号通路参与黄芪多糖对肿瘤坏死因子α诱导的乳大鼠心肌细胞肥大的抑制作用

目的探讨黄芪多糖(APS)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的乳大鼠心肌细胞肥大的保护作用及机制。方法 原代培养乳大鼠心肌细胞分别加入APS 25,50和100 mg.L-1作用30 min后再加入TNF-α50μg.L-1作用48 h。考马斯亮蓝法测定心肌细胞蛋白含量;消化分离法及计算机图像分析系统检测细胞体积;RT-PCR检测心肌心钠素(ANP)和Toll样受体4(TLR4)的mRNA表达;Western印迹法检测心肌细胞p65和IκBα的蛋白表达;ELISA法检测细胞外液白细胞介素1β(IL-1β)的含量。结果 与正常对照组相比,TNF-α组心肌细胞蛋白含量增加了52.8%,细胞体积增大了66.7%,ANP和TLR4 mRNA分别增加了60.3%和68.7%,p65蛋白表达增加了50.5%,IκBα蛋白表达减少了43.1%,IL-1β表达增加了59.0%,差异均有统计学意义(P<0.01)。与TNF-α模型组相比,APS 50,100 mg.L-1和IκBα阻断BAY11-7082 5μmo.l L-1组蛋白含量、细胞体积、ANP mRNA、TLR4 mRNA、IL-1β和p65蛋白表达显著降低(P<0.05),IκBα蛋白表达明显增高(P<0.05);APS 25 mg.L-1组蛋白含量、细胞体积和ANP mRNA表达显著性降低(P<0.05)。结论 APS对TNF-α诱导的乳大鼠心肌细胞肥大有保护作用,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。

黄芪多糖对腹主动脉缩窄致大鼠心肌肥厚能量代谢紊乱的抑制作用

目的探讨黄芪多糖(APS)对腹主动脉缩窄(AAC)致大鼠心肌肥厚的抑制作用及其机制。方法大鼠采用结扎腹主动脉的方法制备AAC模型,1周后ig给予大鼠APS 200,400和800 mg.kg-1,每天1次,共11周。计算心脏质量指数(HMI)和左心室质量指数(LVMI);测定左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)和左心室内压最大升降速率(±dp/dtmax),HE染色观察大鼠左室心肌形态学改变;测定左心室乳酸(LAC)、游离脂肪酸(FFA)含量;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定心肌心钠素mRNA(ANPmRNA)表达;测定心肌细胞线粒体膜电位(MMP)。结果与假手术组相比,AAC模型组的大鼠,MMP明显降低,其他指标均显著增高。与模型组相比,APS 800 mg.kg-1组HMI,LVMI,LVSP,LVEDP和±dp/dtmax均显著降低(P<0.05);APS 400和800 mg.kg-1组ANP mRNA表达明显下降,MMP明显升高(P<0.05);APS200,400和800 mg.kg-1组LAC水平明显降低(<0.05)。结论 APS能够有效抑制AAC大鼠心肌肥厚并改善其能量代谢紊乱,提高线粒体的活力。

邻苯二甲醛柱前衍生化高效液相色谱法测定组织中肌肽含量

目的建立测定小鼠各组织肌肽含量的高效液相色谱法。方法采用c18色谱柱，以甲醇和0．05mol／L磷酸盐缓冲液（pH3．5）为流动相，用邻苯二甲醛为柱前衍生剂，在柱温38℃下采用二元梯度洗脱，对小鼠各组织中的肌肽含量进行了测定。结果肌肽在0．63—10．00μg／mL时峰面积与进样质量浓度有良好的线性关系，其相关系数为0．9996。回收率在98．2％～99．7％之间。检测限为0．05pg／mL（S／N=10）。结论该法灵敏可靠、专属性强、重现性好。小鼠心脏、肝脏、肾脏、大脑皮层和海马中肌肽含量分别为123．67，22．86，158．86，76．57，81．86mg／g。

黄芪甲苷对高糖诱导的乳大鼠心肌肥大的保护作用

目的探讨黄芪甲苷对高糖诱导的心肌细胞肥大的保护作用。方法利用体外培养模型,以25mmol/L高糖诱导心肌肥大。新生大乳鼠心肌细胞分为正常对照组、高糖组、高糖+16μmol/L黄芪甲苷组、高糖+32μmol/L黄芪甲苷组和高糖+64μmol/L黄芪甲苷组,用Lowry法检测心肌细胞蛋白含量;消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;MTT法检测细胞存活率;采用Till阳离子测定系统,以Fura-2/AM为荧光探针,观察心肌细胞[Ca2+]i的瞬间变化。结果与正常对照组相比,高糖使心肌细胞蛋白质含量增加35.7%,体积增大81.3%,[Ca2+]i瞬变增加62.5%%,心肌细胞存活率降低36.1%。加入16μmol/L黄芪甲苷后,与高糖组相比,心肌细胞蛋白质的含量和细胞体积分别降低20.3%和10.6%,[Ca2+]i瞬间变化降低8.0%,心肌细胞的存活率增加20.0%。结论黄芪甲苷对高糖诱导的乳大鼠心肌细胞肥大具有保护作用。

Z24对大鼠肝脏CYP450酶系的影响

目的:观察Z24对大鼠肝脏CYP450酶系的影响。方法:雌性Wistar大鼠,灌胃(ig)给予Z24(0,50,100,200 mg.kg-1.d-1),连续5 d,以0.9%氯化钠溶液作对照,末次给药后次日,处死大鼠,测定肝微粒体中CYP450总含量、细胞色素b5(Cyt-b5)含量、NADPH-CYP450还原酶活性以及1A2,1B1,2E1,3A4亚型活性。结果:与对照组相比,各剂量组CYP450总含量、NADPH-CYP450还原酶活性及CYP1B1、2E1亚型活性均明显升高(P<0.05);100和200 mg.kg-1组Cyt-b5含量升高(P<0.05);200 mg.kg-1组CYP1A2和3A亚型活性升高(P<0.05)。结论:Z24对CYP450、NADPH-CYP450还原酶及CYP1B1、2E1亚型有诱导作用,剂量达100和200 mg.kg-1时分别对Cyt-b5和CYP1A2、3A亚型产生诱导作用。

Z24对大鼠肝脏抗氧化体系的影响

目的研究Z24对大鼠肝脏抗氧化体系的影响。方法雌性Wistar大鼠,灌胃给予Z24(0、50、100、200 mg/kg),1次/d,连续5 d,以生理盐水作对照。给药结束后次日,检测血浆生化指标,肝匀浆丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量和铜锌-超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活力,并做肝组织病理学检测。结果100、200 mg/kg组丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TB1)升高(P<0.05),200 mg/kg组总胆汁酸(TBA)降低(P<0.05),光学显微镜下见各给药组均出现肝细胞空泡变性和纤维组织增生,电子显微镜下见200 mg/kg组有线粒体嵴断裂等改变,表明该剂量下Z24已引起了肝损伤。50 mg/kg组CuZn-SOD活力代偿性升高,100、200 mg/kg组GSH-Px活力降低(P<0.05),各给药组GST活力均升高,未见MDA含量升高和GSH含量降低,表明该剂量下Z24未引起肝氧化和抗氧化能力失平衡。结论Z24对GSH-Px有抑制作用,但氧化应激效应并不是Z24肝毒性作用的主要机制。

小牛肝提取物对新生小鼠肝细胞损伤的影响

目的 研究不同浓度的小牛肝提取物对新生小鼠肝细胞损伤的影响。方法 采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液,以低血清进行肝细胞原代培养,12-16 h后用0.1 mmol/L的H2O2诱导肝细胞损伤,同时加以不同浓度的肝提取物,观察（100-1 000）mg/L的小牛肝提取物对肝细胞损伤的影响。结果 小牛肝提取物在100 mg/L时即可起到保护肝细胞损伤的作用,但效果不明显,在500 mg/L时可明显保护肝细胞损伤,之后随着浓度的加大保护作用逐渐减弱。结论 小牛肝提取物对H2O2诱导的肝细胞损伤具有一定的保护作用,其中以浓度为500 mg/L时效果最明显。

黄芪多糖通过调控PGC-1α抑制异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚

目的探讨黄芪多糖(APS)对异丙肾上腺素(ISO)诱导心肌肥厚中能量代谢的影响。方法以ISO 15mg/(kg·d)腹腔注射制备大鼠心肌肥厚模型。60只SD大鼠随机分为6组,每组10只:对照组、ISO组、ISO+APS200 mg/(kg·d)组、ISO+APS 400 mg/(kg·d)组、ISO+APS 800 mg/(kg·d)组、ISO+普萘洛尔40 mg/(kg·d)组。APS 200、400、800 mg/(kg·d)及普萘洛尔40 mg/(kg·d)组连续腹腔注射所对应药物3周,并在注射药物一天后腹腔注射ISO 2周。在给药3周后,分别检测大鼠心脏质量指数(HMI)、左心室质量指数(LVMI)、左心室舒张期末压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP),取左心室组织进行HE染色,测量左心室心肌细胞横径(TDM);RT-PCR检测心肌组织心房钠尿因子(ANF)、过氧化体增殖物激活型受体γ共激活因子1α(PGC-1α)mRNA的表达;Western blot检测心肌组织PGC-1α的蛋白表达;ELISA检测血清中游离脂肪酸(FFA)、AMP、ADP、ATP的含量。结果与对照组相比,ISO组大鼠表现为HMI和LVMI显著增加,LVEDP增大,LVSP降低,ANF mRNA表达增加,PGC-1α蛋白含量减少,FFA升高,ATP/ADP、ATP/AMP比值明显降低。与ISO组相比,APS不同剂量组表现为HMI和LVMI降低,LVDEP降低,LVSP升高,ANF mRNA表达减少,PGC-1α蛋白含量增加,FFA降低,ATP/ADP、ATP/AMP比值增加,且呈一定的剂量依赖性。结论 APS能改善ISO诱导的心肌肥厚,其机制可能是调控PGC-1α来提高能量代谢保护心脏。

紫杉醇白蛋白片段纳米粒的制备

目的:利用蛋白酶解和纳米粒技术在白蛋白片段的基础上筛选制备紫杉醇纳米粒的新型载体,并考察相关理化指标。方法:利用牛血白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)酶解片段作为载体,分散乳化-旋蒸去溶剂法制备紫杉醇-BSA酶解片段-纳米粒,在外观、粒径分布、收率、包封率、载药量及体外释药性方面对样品进行考察。结果:BSA酶解后经粗分离得到4个片段组,选择第4组为候选载体,得到的纳米粒外观形态圆整、均匀,初制备纳米粒混悬剂平均粒径为150.2 nm,平均收率为(45.132±0.903)%,平均包封率为(50.246±0.712)%,平均载药量为(4.804±0.101)%,48 h累计释药82.4%。结论:利用白蛋白酶解片段制备紫杉醇纳米粒是可行的,为扩大紫杉醇纳米粒的载体来源、降低制备成本提供了可能。

银杏酮酯对过氧化氢诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用

目的探讨银杏酮酯(Ginkgo biloba extract 50,GBE 50)对过氧化氢诱导的大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用。方法利用体外培养模型,以过氧化氢0.2 mmol.L-1诱导心肌细胞损伤。乳大鼠心肌细胞分为正常对照组、过氧化氢组、过氧化氢+银杏酮酯0.2 mg.mL-1组。用MTT法检测心肌细胞存活率;Western Blot方法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达水平。结果与正常对照组相比,过氧化氢组使心肌细胞的存活率显著降低(P<0.01),Bcl-2的蛋白表达水平明显降低(P<0.01),而Bax和Caspase-3蛋白表达水平显著增加(P<0.01),Bcl-2/Bax的比率降低(P<0.01);与过氧化氢组相比,过氧化氢+银杏酮酯组中,心肌细胞的存活率升高显著(P<0.01),银杏酮酯使Bcl-2的蛋白表达水平明显升高,Bax和Caspase-3的蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bcl-2/Bax的比率升高(P<0.01)。结论银杏酮酯对过氧化氢诱导的乳大鼠心肌细胞凋亡具有抑制作用。

小牛血清去蛋白注射液对糖尿病性周围神经病的症状和神经传导功能的影响

周围神经病是糖尿病最常见的并发症之一，临床上表现为对称性多发性周围神经病和非对称性单一性或多发性神经病，目前尚无有效的防治措施及特效治疗药。小牛血清去蛋白注射液（商品名：奥德金），含有小分子肽、磷酸肌醇寡糖、氨基酸等多种生物活性物质，是一种神经营养剂，日前该药临床上主要用于脑血管疾病的治疗。2005年1月～2006年6月，我们使用奥德金治疗2型糖尿病并发周围神经病患者31例，观察了临床症状的改善并测定了治疗前后的神经传导速度的变化，现将结果报道如下。

糖尿病合并感染96例临床分析

目的：探讨糖尿病合并感染的临床特点及防治措施。方法：回顾性分析2002年6月-2005年6月96例糖尿病合并感染患者的临床资料以及感染的因素、部位等。结果：178例住院患者合并感染96例,感染率53.9%。合并感染的部位：呼吸道、泌尿道、皮肤粘膜、消化道等。主要以感染革兰阴性菌（大肠杆菌）为主。结论：糖尿病患者机体抵抗力降低,合并感染机会增加,而针对不同的病人、不同病情和病症制定综合防治计划和预防措施,是降低糖尿病患者感染率和病死率的有效措施。

地黄寡糖及其主要成分对大鼠脑片氧化应激损伤保护作用研究

目的:探讨地黄寡糖及其主要组分对H2O2所致大鼠大脑皮质和海马脑片氧化应激损伤的保护效果。方法:取SD大鼠大脑皮质和海马制作脑片,然后随机分为对照组(Control);单纯地黄寡糖用药组(ROS);单纯水苏糖组(stachyose);单纯梓醇组(catalpol);H2O2损伤组(H2O2);损伤前地黄寡糖预处理组(ROS+H2O2);损伤前水苏糖预处理组(stachyose+H2O2);损伤前梓醇预处理组(catalpol+H2O2)。TTC染色法检测脑片组织损伤百分率,比色法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:H2O2孵育30min明显损伤大鼠海马和皮质脑片,组织损伤率明显升高,LDH释放增加(P<0.01)。8、40、200 mg/L的地黄寡糖或120 mg/L的水苏糖、20 mg/L的梓醇可不同程度改善H2O2所致的氧化应激损伤引起的组织损伤,减少LDH的漏出,但各成分均对对照组脑片无影响。结论:地黄寡糖、水苏糖、梓醇均能减轻H2O2所造成的氧化应激损伤。梓醇相比水苏糖在地黄寡糖中起主要作用。

黄芪多糖通过Toll样受体4/核转录因子-κB信号通路抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大

目的探讨黄芪多糖抑制异丙肾上腺素(Iso)诱导心肌细胞肥大的作用及机制。方法原代培养SD乳鼠心肌细胞,用Iso 10μmol/L诱导心肌细胞肥大,观察核转录因子-κB(NF-κB)特异性抑制剂BAY11-7082及不同浓度黄芪多糖对肥大心肌细胞的影响。用消化分离法及计算机图像分析系统测细胞体积;考马斯亮蓝法测心肌细胞总蛋白含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞外液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的含量;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心房钠尿肽(ANP)mRNA和Toll样受体4(TLR4)mRNA的表达;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测心肌细胞P65、NF-κB抑制蛋白IκBα和TLR4蛋白的表达。结果与正常对照组相比,Iso组心肌细胞体积增大88.3%,总蛋白含量增加55.3%,ANP mRNA表达增高,炎症因子TNF-α和IL-6的含量分别增加200%和65.9%,TLR4mRNA表达增高,P65和TLR4蛋白含量增多及IκBα蛋白含量减少。黄芪多糖和BAY11-7082均能有效抑制Iso诱导的心肌细胞肥大,表现为体积减小,总蛋白含量降低,ANP mRNA表达降低;均能有效减少炎症反应,表现为细胞外液中TNF-α和IL-6明显减少;均使TLR4mRNA表达降低,P65和TLR4蛋白含量减少及IκBα蛋白含量增多,且黄芪多糖呈一定的剂量依赖性。结论黄芪多糖对Iso诱导的乳鼠心肌细胞肥大有保护作用,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路有关。

人参皂苷Rg1对腹主动脉缩窄致大鼠心肌肥厚和TLR4的影响

目的:探讨人参皂苷Rg1对腹主动脉缩窄(AAC)致心肌肥厚的抑制作用及其机制。方法:大鼠采用腹主动脉结扎的方法制备AAC模型,1周后ig给予大鼠人参皂苷Rg1 4,2,1 mg/kg,每天1次,共11周。计算心脏质量指数(HMI)和左心室质量指数(LVMI);测定左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)和左心室内压最大升降速率(±dp/dt max),HE染色观察大鼠左室心肌形态学改变;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定心肌ANP和TLR4 mRNA表达;采用Western blot测定p65和IκBα的蛋白表达,采用ELISA测定血清中TNF-α和IL-1β的表达。结果:与假手术组相比,AAC模型组的大鼠IκBα明显降低,其他指标均显著增高。与模型组相比,人参皂苷Rg1 4 mg/kg组HMI,LVMI,LVSP,LVEDP和±dp/dt max均显著降低(P<0.05);人参皂苷Rg1 4,2 mg/kg组ANP mRNA,TLR4 mRNA,p65蛋白表达,血清中TNF-α和IL-1β表达明显下降(P<0.05),IκBα蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1能够有效抑制AAC大鼠心肌肥厚并改善炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路表达有关。

小牛血清去蛋白注射液对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的影响

目的:通过观察小牛血清去蛋白注射液(DCSI)对2型糖尿病胰岛素抵抗模型大鼠血糖和血脂水平的影响,研究DC-SI对胰岛素抵抗的改善作用。方法:以高脂高糖饮食加链脲佐菌素制作2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型,观察DCSI对大鼠葡萄糖耐量(OGTT)、血胰岛素含量(INS)以及甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHO)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、游离脂肪酸(FFA)的影响,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果:DCSI可明显降低糖尿病大鼠INS、TG、CHO、LDL、FFA含量,升高HDL含量,改善OGTT,使HOMA-IR降低。结论:DCSI具有较好的降血糖、降胰岛素、降血脂、改善胰岛素抵抗、防治糖尿病并发症的作用。

小牛血清去蛋白注射液对2型糖尿病合并脑梗死模型大鼠胰岛素抵抗的影响

目的:观察小牛血清去蛋白注射液(DCBI)对2型糖尿病合并脑梗死模型大鼠血糖、血脂代谢的影响及其对胰岛素抵抗(IR)的改善作用。方法:大鼠用高脂高糖饮食伴尾静脉注射链脲佐菌素复制2型糖尿病模型,成功后再建立大鼠大脑中动脉栓塞模型,分为模型组、假手术组、DCBI(低、高剂量,30、60mg·kg-1·d-1,腹腔注射)组和对照药罗格列酮组;并设立正常组。各组给予相应试药5周后,测定空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FI NS)、糖耐量(OGTT)水平,并计算胰岛素抵抗指数(IRI)、胰岛素敏感指数(ISI),测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)水平。结果:与模型组比较,DCBI治疗后可显著降低2型糖尿病合并脑梗死模型大鼠FBG水平及增强糖耐量(P<0.01),对FI NS水平的改变不明显(P>0.05);改善机体对胰岛素的抵抗性(P<0.01或P<0.05);并明显降低TC、TG、LDL-C、NEFA水平及升高HDL-C水平(P<0.01),改善高脂状态。结论:DCBI可降低2型糖尿病合并脑梗死模型大鼠血糖,调节血脂代谢紊乱,具有改善IR的作用。