HGT KAPs基因家族在辽宁绒山羊皮肤毛囊中的表达研究

为进一步探索高甘氨酸/酪氨酸角蛋白关联蛋白基因家族(HGT KAPs)与辽宁绒山羊羊绒品质——绒毛纤维直径的关系,本研究运用半定量RT-PCR检测KAP6-1.2、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.1和KAP8.2在皮肤及各组织中的表达,通过原位杂交对其进行定位分析,采用实时荧光定量PCR检测兴盛期、退行期基因的相对表达量。结果表明:5个基因特异地表达于皮肤,在初、次级毛囊的皮质层、内根鞘中有明显的表达信号。KAP6-1.2和KAP8.1在兴盛期初次级毛囊的表达量差异不显著,KAP6.2在兴盛期、退行期初级毛囊的表达量均高于次级毛囊,而KAP7.1、KAP8.2在兴盛期次级毛囊的表达量高于初级毛囊,而退行期与之相反。因此推测,HGT KAPs基因家族在调控辽宁绒山羊绒毛纤维直径方面具有重要的作用,是编码羊绒结构蛋白的基因。

七鳃鳗myd88基因的生物学特性及其下游分子的表达模式分析

髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MYD88)是Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路的关键接头分子,在先天性免疫和适应性免疫中都起到重要作用。为了揭示七鳃鳗Myd88的生物学功能,研究首次从七鳃鳗(Lampetra japonica)中克隆了myd88基因,其ORF为852 bp,共编码283个氨基酸,推测的分子量为32.432 k D,等电点为6.25,无信号肽。多重序列比对表明七鳃鳗Myd88的氨基酸序列与其他物种同源性较高,具有高度保守的N端死亡结构域和C端的TIR结构域的Box1、Box2和Box3基序。实时荧光定量PCR分析表明:myd88基因在七鳃鳗各组织中均有低水平转录表达,鳃中表达量最高,其次是肌肉、髓和肾。脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后,七鳃鳗myd88在白细胞中表达量升高最显著,其次是在鳃中的表达量也明显升高,表明七鳃鳗Myd88参与七鳃鳗的抗菌免疫过程。此外,LPS刺激七鳃鳗还能诱导TLR信号通路Myd88依赖途径的下游信号分子Irak1、Traf6、Ikkβ和Nfkb在各组织中的转录表达。研究结果表明七鳃鳗中可能存在TLR/Myd88信号通路,为进一步探究该信号通路参与免疫应答的起源与进化奠定了基础。

辽宁新品系绒山羊微卫星标记与经济性状相关性的研究

为了在生产实践中进行多目标性状的选育,本研究利用微卫星标记技术对辽宁新品系绒山羊所有染色体(29条)上125个微卫星位点进行了研究,分析了体质量、绒产量和绒细度3个经济性状与标记基因型的关系。结果表明,除BM1312等10个为单态外,其余111个呈高度多态(PIC>0.5),4个呈中度多态(0.25<PIC<0.5)。并对呈多态的115个微卫星位点经济性状的相关关系进行分析,找到了与体质量、绒产量和绒细度相关的优势基因型,特别是发现了MoM064位点的DE基因型(112～117bp)为绒细度和绒产量性状的共同优势基因型。此项研究为在生产实践中进行多目标性状的选育提供了试验依据。

MT和FGF5调控辽宁绒山羊绒毛生长相关LncRNA的筛选及鉴定

【目的】筛选出辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞中与绒毛生长相关的LncRNA,为绒毛生长相关LncRNA的功能及机制研究提供基础性数据。【方法】提取MT和FGF5处理的辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞总RNA,通过样品总RNA电泳检测、测序数据质量评估、Mapping比对、样品间相关性检查对提取的总RNA进行质量检测。筛选出差异表达的LncRNA并预测其靶基因,通过GO和KEGG富集分析,筛选出与绒毛生长相关的LncRNA,并通过Real-time PCR对目标LncRNA进行表达验证。【结果】(1)样品总RNA质量检测结果显示:RNA完整性良好、GC含量相对较高,序列较稳定、样品间表达水平相关性均较高、符合测序要求。(2)差异表达LncRNA的筛选结果显示:1.0g·L^(-1) 24h组差异表达LncRNA有32个,其中4个表达上调,28个表达下调;0.2g·L^(-1) 24h组差异表达LncRNA有10个,其中4个表达上调,6个表达下调;0.2g·L^(-1) 72h组差异表达LncRNA有113个,其中5个表达上调,108个表达下调。10^(-4) g·L^(-1) 24 h组差异表达LncRNA有164个,其中有70个上调,94个下调;10^(-4)g·L^(-1) 72 h差异表达LncRNA有189个,其中有78个上调,111个下调;10^(-6) g·L^(-1) 24 h组差异表达的LncRNA有123个,其中有27个上调,96个下调。(3)靶基因GO富集分析结果显示:1.0g·L^(-1) 24h组差异表达LncRNA靶基因富集在GO的negative regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter;0.2g·L^(-1) 24h组无差异表达LncRNA靶基因富集的GO term;0.2g·L^(-1) 72h组差异表达LncRNA靶基因富集在GO的cellular metabolicprocess biological_process,binding molecular_function,FGF5处理组中只有10^(-4) g·L^(-1) 72 h组差异表达LncRNA靶基因富集在cell cellular_component、cell part cellular_component、intracellular cellular_component、binding molecular_function等6个条目。(4)靶基因KEGG富集分析结果显示:1.0g·L^(-1) 24h组差异表达LncRNA靶基因富集在Steroid biosynthesis pathway;0.2g·L^(-1) 24h组无差异表达LncRNA靶基因富集的Pathway term;0.2g·L^(-1) 72h组差异表达LncRNA靶基因富集在Cell cycle,DNA replication,Steroid biosynthesis,TNF,Nod-likereceptor,NF-kappa B等信号通路,其中TNF和NF-kappa B信号通路与绒毛生长相关。FGF5处理组中,10^(-4) g·L^(-1)72 h组差异表达的LncRNA靶基因显著富集到Fanconi anemia pathway,Huntington's disease,Metabolic pathway,Aminoacyl-tRNA biosynthesis等9个pathway term,其中Metabolic信号通路与绒毛生长相关;10^(-4) g·L^(-1) 24 h组差异表达的LncRNA靶基因无显著富集的pathway term;10^(-6) g·L^(-1) 24 h组差异表达的LncRNA靶基因只富集在Taste transduction pathway。(5)NF-κB和TNF两个信号通路中富集的靶基因TNFα、TNFAIP3(A20)、NFKBIA(IkBα)、NFKB2、IL8所对应的LncRNA有2个,分别为(Gene ID):XLOC_005914;XLOC_018763;Metabolic信号通路中靶基因所对应的LncRNA有4个,分别为(Gene ID):XLOC_011424、XLOC_009522、XLOC_009063、XLOC_01115。Real-time PCR结果显示:LncRNA XLOC_011424、XLOC_011157、LncRNA XLOC_005914和XLOC_018763与高通量测序结果一致。【结论】LncRNA XLOC_011424、XLOC_011157、LncRNA XLOC_005914和XLOC_018763可能通过调控与绒毛生长相关的NF-κB、TNF或Metabolic信号通路,提高羊绒密度和长度,进而提高辽宁绒山羊绒产量及品质。

辽宁绒山羊UMP/CMP激酶基因的表达及分析

在前期构建辽宁绒山羊皮肤cDNA文库的基础上,测通得到了新基因UMP/CMP激酶的全长序列,并对UMP/CMP激酶基因进行生物信息学分析。然后,通过RT-PCR检测该基因在心、肝、脾、肺及肾中的表达。生物信息学分析显示,UMP/CMP激酶基因全长1 081 bp,能够编码含有228个氨基酸的蛋白质,亮氨酸、甘氨酸、赖氨酸含量较高。UMP/CMP激酶含有较高比例的无规卷曲结构(51.75%),并发现其含有UMP/CMP激酶蛋白结构域。蛋白三级结构、进化树分析显示,辽宁绒山羊和牛的UMP/CMP激酶基因的同源性最高。UMP/CMP激酶基因存在跨膜结构域,并且存在信号肽剪切位点。该基因中有8个Ser,2个Thr,2个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化位点。RT-PCR检测显示,UMP/CMP激酶基因特异地表达于皮肤。这些研究结果为深入研究辽宁绒山羊的种质遗传特性奠定了基础。

七鳃鳗g型溶菌酶的分子特征和抗菌活性

溶菌酶是先天免疫系统中对抗细菌病原体感染的一种关键蛋白.本研究从七鳃鳗中克隆g型溶菌酶基因.其酶基因c DNA为701 bp(Gen Bank序列号KP204854),开放阅读框为555 bp,编码由184个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为20.24 k D,等电点为5.48,含有1个半胱氨酸残基,无信号肽.实时荧光定量PCR分析表明,七鳃鳗g型溶菌酶基因在各组织中广泛表达,其中在肠中表达量最高.脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后发现,溶菌酶在口腔腺和头肾表达量显著升高.以溶壁微球菌和哈维弧菌为底物检测重组g型溶菌酶的活性时,均表现出抗菌活性,最适p H为7.5,最适温度为35℃.扫描电镜分析表明,重组酶能够使溶壁微球菌破裂.以上结果均表明,g型溶菌酶在七鳃鳗的先天免疫系统防御病菌感染中起到重要作用.

七鳃鳗水通道蛋白3的克隆与生物学特性分析

水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)属于水甘油通道蛋白家族,参与水、尿素和甘油的转运和促进细胞增殖及迁移。从七鳃鳗中克隆得到了Aqp3(LjAqp3)cDNA(Gen Bank序列号KR054618),其开放阅读框为900 bp,编码299个氨基酸,含6个跨膜螺旋结构域,有信号肽。序列分析结果表明,七鳃鳗AQP3有2个高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(NPA)模体和1个芳香族/精氨酸(ar/R)结构。进行同源序列比对发现与其它物种具有较高的同源性。实时荧光定量PCR分析表明,Lj Aqp3在七鳃鳗中分布广泛,在多种组织器官中表达。

地榆对MRSA生物被膜形成的抑制作用

目的研究地榆对MRSA41577菌株生物被膜(bacterial biofilm,BF)的抑制作用。方法采用刚果红法和结晶紫半定量法检测供试菌株BF的形成能力;采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定地榆对MRSA41577BF形成和成熟BF的抑制作用,以及地榆与万古霉素联用对MRSA41577成熟BF的抑制作用。结果地榆对MRSA41577BF形成和成熟BF有显著的抑制作用,其抑制MRSA41577BF形成的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)分别为1 mg/m L和8 mg/m L。抑制MRSA41577成熟BF的MIC为4 mg/m L。当用亚抑菌浓度的地榆与万古霉素联合作用后,可显著提高成熟BF对万古霉素的敏感性。万古霉素的浓度≤64μg/m L时,对MRSA41577成熟BF没有破坏作用,当1/4MIC的地榆与4μg/m L万古霉素联用,即可对供试菌株成熟BF有抑制作用。结论地榆对MRSA41577BF形成有显著的抑制作用,其作用机制与地榆破坏BF结构,使万古霉素等抗生素渗透到BF内来完成杀菌作用有关。

黄芩素抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成

细菌生物被膜的形成是导致细菌耐药和引起持续性感染的主要原因之一。本文通过检测黄芩素对金黄色葡萄球菌26112菌株(Staphylococcus aureus 26112,SA26112)多糖细胞间黏附素(polysaccharide intercellular adhesion,PIA)的合成和胞外DNA(extracellular DNA,e DNA)释放量的影响,及其对ica A和cid A基因表达量的影响,探讨黄芩素对金黄色葡萄菌生物被膜形成的抑制作用及其机制。结果显示,黄芩素能抑制SA26112生物被膜的形成,其抑杀SA26112的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度均为0.04 mg/m L。0.16 mg/m L黄芩素和256μg/m L环丙沙星单独作用时,均不能杀死其成熟生物被膜内的SA26112细菌,而当二者联用时则可杀死成熟生物被膜内的细菌。黄芩素能显著抑制SA26112菌株PIA的合成、e DNA的释放量及ica A和cid A基因的相对表达量。其中,0.04 mg/m L黄芩素作用SA26112菌株24 h,与对照组相比,e DNA的释放量减少97%,ica A和cid A基因的相对表达量分别减少62%和41%。上述结果表明,黄芩素能抑制SA26112菌株生物被膜的形成,其作用机制可通过降低ica A和cid A的基因表达量,进而影响PIA的合成和e DNA的释放,来抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。

五倍子抑制MRSA生物被膜形成的作用机制

目的研究五倍子对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）41577菌株生物被膜（bacterial biofilm,BF）的抑制作用及机制。方法采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定五倍子对MRSA 41577 BF形成和成熟BF的抑制作用;采用刚果红法测定五倍子对MRSA 41577 PIA合成的影响;采用微量紫外分光光度计测定五倍子对MRSA 41577 e DNA释放的影响;采用RT-PCR技术测定五倍子对MRSA 41577 ica A和cid A基因表达量的影响。结果五倍子对MRSA 41577 BF形成和成熟BF有显著的抑制作用,其抑制MRSA 41577 BF形成的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）和最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MIC）为0.5 mg/mL和1 mg/mL。抑制MRSA 41577成熟BF的MIC和MBC为4 mg/mL和16 mg/mL。刚果红检测结果显示,五倍子能抑制MRSA 41577 PIA的合成,且呈浓度剂量依赖。微量紫外分光光度计结果显示,五倍子能抑制MRSA 41577 e DNA的分泌释放,其中当五倍子的浓度为1/2MIC时,eDNA分泌释放量为3.61μg/OD_（595）,对照组分泌释放量为11.91μg/OD_（595）,2者相比,e DNA的分泌释放量减少了69.7%（P〈0.01）。RT-PCR结果根据2^（-△△CT）公式计算显示,五倍子能够抑制ica A及cid A的基因表达量,五倍子浓度为1/2MIC时,ica A和cid A基因表达量分别为9.7%和6.67%,对照组icaA和cidA基因表达量均为100%,与对照组比较,ica A和cid A基因表达量分别减少90.3%和93.3%（P〈0.01）。结论五倍子抑制MRSA 41577生物被膜的作用机制,主要是通过抑制ica A及cid A基因的表达量,进而影响PIA的合成以及e DNA的分泌释放实现的。

五倍子对白色念珠菌生物被膜的抑制作用

目的研究五倍子对白色念珠菌菌株生物被膜的抑制作用。方法采用MTT法测定五倍子对生物被膜的形成及成熟生物被膜的抑制作用。采用RT-PCR法测定五倍子对ALS1和CPH1基因表达量的影响。结果五倍子能显著抑制白色念珠菌生物被膜的形成,其抑制生物被膜形成的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）均为128 mg/mL。五倍子对白色念珠菌的成熟生物被膜也有较强的抑制作用,其抑制成熟生物被膜的MIC为256 mg/mL。五倍子能显著降低白色念珠菌ALS1和CPH1的基因表达量,其中64 mg/mL的五倍子作用白色念珠菌16 h后,与对照组相比,ALS1和CPH1的基因表达量分别降低了79.2%和82.0%。结论五倍子对白色念珠菌生物被膜的形成和成熟生物被膜均具有显著的抑制作用,其作用机制可能与降低ALS1和CPH1的基因表达量,抑制白色念珠菌的粘附和侵袭有关。

大黄素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制

以金黄色葡萄球菌为供试菌,通过测定大黄素对其细胞膜的通透性、可溶性蛋白质和呼吸代谢的影响,来阐述大黄素的抑菌作用机制.利用电导率、生物大分子分析、呼吸代谢抑制检测等方法,验证大黄素的药效作用.实验结果显示,大黄素作用金黄色葡萄球菌后,培养基溶液中电导率比对照组增加了2.23%,DNA和RNA大分子的含量比对照组增加了67.36%,大黄素作用金黄色葡萄球菌16 h后,菌体可溶性蛋白总量比对照组减少了28.3%;大黄素能抑制金黄色葡萄球菌物质代谢中的2种关键酶的活性,其中琥珀酸脱氢酶活性抑制率为53.8%,苹果酸脱氢酶的活性抑制率为25.5%.上述结果表明,大黄素可以破坏细菌细胞膜的通透性,抑制菌体内的蛋白质合成,通过抑制代谢关键酶的活性发挥杀菌作用.

黄柏等中草药对MRSA的抑菌作用及其对质粒的消除作用

研究黄柏等10种中草药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌作用及黄柏和甘草对MRSA的质粒消除作用。采用牛津杯法测定中草药对耐药性金黄色葡萄球菌的抑菌作用;逐个检出法测定黄柏和甘草对临床分离的MRSA多重耐药菌株的质粒消除作用。结果显示,在10种中草药中,黄柏和甘草对MRSA的抑制作用最好,其对MRSA的最低抑菌浓度(MIC)均是1 mg/mL,且抑菌效果在一定浓度范围内随药液浓度的增大而增强。黄柏和甘草对MRSA的质粒有消除作用,药物作用48 h后,黄柏和甘草对MRSA的质粒消除率分别为17%和12.2%。结果表明,黄柏和甘草对MRSA有显著抑制作用,且对MRSA的质粒有消除作用。

黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌机制的研究

研究黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌活性以及抑菌机制。以MRSA为供试菌,通过研究黄芩素对MRSA的抑制作用及其对细胞膜、蛋白质、拓扑异构酶活性的影响,并观察黄芩素与DNA结合后酶切图谱的变化等方面,较系统地阐述黄芩素对MRSA的抑菌作用机制。结果显示:黄芩素对MRSA有较强的抑制作用,其最小抑菌浓度为0.04mg·mL-1;黄芩素能抑制MRSA菌体蛋白质的合成,当黄芩素作用MRSA 16h后,其菌体蛋白质的含量比对照组降低44.62%;黄芩素能抑制拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性,当黄芩素的浓度为0.025mg·mL-1时即可抑制MRSA拓扑异构酶的活性;当黄芩素与DNA作用一定时间后,TaqⅠ的酶切电泳图谱发生了明显的变化,初步推测黄芩素与DNA的结合位点可能是在T与CGA碱基之间或结合在与T/CGA相类似的碱基位置。上述结果表明,黄芩素对MRSA有显著的抑菌活性,其作用机制可能是通过与DNA发生嵌入作用,抑制DNA拓扑异构酶的活性,使其不能进行正常的复制与转录,进而抑制了下游蛋白质的翻译过程,引起菌体内生物学功能的丧失,从而抑制菌体的生长和繁殖。

大黄素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌作用机制研究

目的研究大黄素对MRSA41577菌株细胞膜、蛋白质和核酸的影响,探讨其对MRSA的抑菌作用机制。方法采用TTC法测定大黄素对MRSA41577的抑制作用;检测细胞电导率和大分子含量确定大黄素对MRSA41577细胞膜的影响;SDS-PAGE检测大黄素对MRSA41577可溶性蛋白的影响;DAPI染色法测定大黄素对MRSA41577核酸含量的影响;紫外吸收光谱分析法检测大黄素与DNA的相互作用方式。结果大黄素对MRSA41577菌株具有显著的抑制作用,其最低抑菌浓度为8μg/m L。8μg/m L的大黄素作用菌体6h,与对照组相比,细胞大分子和电导率分别增加了(71.48±0.026)%(P<0.01)和(2.39±0.102)%(P<0.05)。8μg/m L的大黄素作用菌体16 h,菌体可溶性蛋白的含量与对照组相比降低了32.8%(P<0.01),DNA和RNA含量分别降低了(4.82±1.06)%(P<0.05)和(6.67±0.36)%(P<0.05)。紫外吸收光谱结果显示,大黄素可与DNA发生结合,其结合方式为氢键结合。结论大黄素对MRSA的抑制作用机制主要是破坏菌体细胞膜,通过氢键结合干扰DNA的复制和转录,进而抑制蛋白质的合成,从而破坏菌体的生物学功能。

金针菇与黑木耳醇提物的抗肿瘤和抗氧化作用比较

目的研究比较金针菇和黑木耳醇提物的抗肿瘤作用和抗氧化作用。方法采用MTT法测定金针菇和黑木耳醇提物对MCF-7、He La和A375细胞的抑制作用。DPPH和FRAP法测定金针菇和黑木耳醇提物的抗氧化能力。结果 MTT结果显示,25~400μg/m L浓度范围内的金针菇和黑木耳醇提物对MCF-7、He La和A375细胞均有不同程度的抑制作用,金针菇的抑制作用强于黑木耳,差异有统计学意义（P〈0.05）。与对照组相比,400μg/m L金针菇醇提物对MCF-7、He La和A375的抑制率分别为48.20%、52.61%和50.58%（P〈0.01）,相同浓度的黑木耳醇提物对MCF-7、He La和A375的抑制率分别为37.62%、50.21%和41.59%（P〈0.01）。抗氧化结果显示,金针菇和黑木耳醇提物均具有较好的抗氧化活性,金针菇的抗氧化作用强于黑木耳,差异有统计学意义（P〈0.01）。与对照组相比,1.6 mg/m L的金针菇和木耳醇提物对DPPH·自由基的清除率分别为60.30%和40.43%（P〈0.01）,FRAP值分别为9.5和7.0 mmol/m L（P〈0.01）。结论金针菇和黑木耳均具有较强的抗肿瘤作用和抗氧化作用,金针菇的药理活性优于黑木耳。

没食子酸对金黄色葡萄球菌抑菌活性及机制研究

以金黄色葡萄球菌为供试菌,利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,细胞膜渗透性测定,SDS-PAGE蛋白谱变化等方法对没食子酸的抑菌活性及其机制进行研究,进而验证没食子酸的药效作用。实验结果显示,没食子酸对金黄色葡萄球菌作用其抑菌圈直径为13mm;其对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.01mg.mL-1;当药物作用5h时,实验组的电导率与对照组相比增加了6.38%;大分子的OD值随着作用时间的增加而逐渐增大,当培养至8h时,实验组大分子物质吸光值的变化率达到最大,比对照组增加了74.4%。SDS-PAGE蛋白谱变化实验表明,没食子酸对金黄色葡萄球菌作用20h后,其总蛋白量没有明显变化。上述结果表明,没食子酸对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性,能影响金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性。其抑菌机制是通过破坏细菌细胞膜的完整性来实现的。

磷脂酰胆碱对酒精性肝病保护作用的研究进展

酒精性肝病已逐渐成为第二大肝脏疾病,威胁着人类的健康。乙醇引发肝损伤的机制主要包括其代谢产物乙醛对肝细胞造成的毒性作用、自由基损伤及对肝脏线粒体产生的毒性作用等。已证实,磷脂酰胆碱对酒精肝损伤具有明显的保护作用。简要介绍了酒精肝病机制及磷脂酰胆碱对酒精性肝损伤的保护作用研究进展,以期为治疗酒精性肝病提供帮助。

慢病毒介导小鼠K26/KAP26.1基因过表达对相关基因的调控作用

【目的】利用慢病毒介导过表达技术,明确小鼠K26和KAP26.1基因过表达后对角蛋白关联蛋白基因KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1和对骨形态发生蛋白基因BMP-4、BMPR-IB的影响,探究小鼠绒毛细度变化的影响机制,达到人为调控(如慢病毒载体技术)使相关基因过表达,改善动物绒毛品质的目的,为哺乳动物绒毛细度调控的研究奠定理论基础,【方法】试验在辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室完成,小白鼠采自大连医科大学实验动物中心,选取出生后5周龄昆明种雄鼠。在Genebank查找到小鼠基因K26(Gene ID:NM_001033397)及KAP26.1(Gene ID:NM_027105.2)序列,根据目的基因序列设计引物,将质粒转入生长状态良好的293T细胞,构建小鼠K26和KAP26.1基因慢病毒过表达载体,将含有目的基因K26及KAP26.1的慢病毒表达载体分别转染小鼠皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察其转染情况,确定慢病毒表达载体转染成功后,从病毒感染后的细胞中抽提总RNA,将RNA反转录成c DNA后放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪,检测K26和KAP26.1基因过表达对KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因表达的影响。【结果】经RT-PCR检测,证明小鼠慢病毒载体p Lenti6.3-K26-IRES-EGFP和p Lenti6.3-K26.1-IRES-EGFP构建成功。经荧光场对比,发现目的慢病毒载体转染293T细胞72h时转染率最高。经PCR检测,证实包装好的目的慢病毒K26及KAP26.1转染小鼠成纤维细胞72 h后转染成功。经RT-PCR检测与SPSS Statistics 19软件分析目的基因表达量与阳性对照组(空载体质粒组,BLACK)、阴性对照组(小鼠表皮成纤维细胞,NC)表达量之间的显著性差异,发现K26基因过表达会导致KAP26.1基因上调,反之亦然,说明K26和KAP26.1基因之间存在一定的协同作用;K26和KAP26.1基因过表达后,均能导致KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因下调;K26基因过表达能使BMP-4基因表现为上调,而BMPR-IB基因表现为下调;KAP26.1基因过表达时,BMP-4和BMPR-IB基因均表现为上调。【结论】K26与KAP26.1基因在毛囊的内根鞘中起到协同作用,K26和KAP26.1基因的高表达会抑制KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因的表达,影响m TOR下游蛋白合成信号,进而起到调节绒毛粗细的作用;K26和KAP26.1基因过表达均能使BMP-4基因表现为上调,BMP-4是BMP信号通路的激活剂,能够激活BMP信号通路向下游转导,进而影响到毛囊的发育周期;K26基因过表达下调BMPR-IB基因的表达,而KAP26.1基因过表达上调BMPR-IB基因的表达,BMPR-IB基因是BMP信号的Ⅰ型受体,当BMPR-IB受体减少时,会抑制BMP信号向下游转导,从而使绒毛生长周期重新开始;当BMPR-IB受体增加时,会促进下游信号分子转录,进而影响毛囊发育周期。说明K26和KAP26.1基因过表达均能激活BMP信号通路,并由BMP和m TOR信号调节KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因的表达,但K26与KAP26.1基因对BMPR-IB基因的相反调节作用有待深入研究。

虎眼万年青提取物对白色念珠菌细胞凋亡的影响

目的 研究虎眼万年青（OCA）提取物对白色念珠菌细胞凋亡的影响,阐述虎眼万年青抑真菌的可能作用机制。方法采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测OCA对白色念珠菌凋亡的影响;JC-1染色检测OCA对线粒体膜电位的影响;DCFH-DA染色检测OCA对活性氧生成的影响。结果 OCA提取物对白色念珠菌有较强的抑制作用,其对白色念珠菌的MIC80与MFC分别为8 mg/m L与32 mg/m L。虎眼万年青提取物能诱导细胞凋亡,减低白色念珠菌的线粒体膜电位,显著增加白色念珠菌的活性氧含量。结论 虎眼万年青提取物抑制真菌的作用机制可能与降低白色念珠菌的线粒体膜电位,提高活性氧的含量,扰乱线粒体功能,最终导致其细胞凋亡有关。