冻干人用狂犬病疫苗原液纯度体积分子排阻高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的 建立冻干人用狂犬病疫苗原液纯度的体积分子排阻高效液相色谱(size exclusion column-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法,并进行验证。方法 采用TSK-gel G6000PWXL色谱柱(7.8 mm×30 cm,13μm)进行测定,流动相为:0.1 mol/L PB缓冲液(pH 7.8);流速为:0.5 mL/min;检测波长为:280 nm;进样量为:20μL;柱温为:30℃。验证方法的系统适用性、专属性、精密性、耐用性,并确定检测限和定量限。采用建立的方法检测3批冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液及1批冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)原液的纯度。结果 参比品与两种基质制备的冻干人用狂犬病疫苗原液目的蛋白色谱峰的分离度均> 1.5,峰拖尾因子均<1.5;空白溶剂在目的蛋白出峰位置无吸收峰,不干扰测定;精密性验证中的保留时间和峰面积RSD均<2.0%;定量限为10μg/mL,检测限为4μg/mL;参比品在278、280、282 nm 3种不同检测波长下连续进样3次,保留时间和峰面积RSD均<2.0%。4批冻干人用狂犬病疫苗原液的纯度均> 97%。结论 建立的冻干人用狂犬病疫苗原液纯度SECHPLC检测方法具有良好的专属性、精密性及耐用性,为人用狂犬病疫苗的质量控制提供了可靠方法。

气相色谱法检测水痘减毒活疫苗原液中二甲基亚砜残留量

目的建立测定水痘减毒活疫苗原液中二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)残留量的气相色谱法,并进行方法学的验证和初步应用。方法采用气相色谱法检测,对色谱柱、柱温、分流比以及供试品预处理方法进行了优化,并对优化后的方法进行系统适用性和专属性、线性和范围、准确度和精密度、定量限和检测限、耐用性的方法学验证。结果色谱柱使用DB-624(30 m×0.53 mm,3.00μm)毛细管柱,以氮气为载气,进样口温度设定为250℃,FID检测器温度设定为270℃,柱温为120℃,分流比为5∶1。供试品在检测前采用乙腈沉淀蛋白的预处理方式(体积比1∶9~1∶19)以去除其中的干扰杂质。方法学验证结果显示,系统适用性和专属性良好,DMSO色谱峰与杂质分离良好,在50~1000μg/mL范围内线性关系良好(R^(2)=0.9999)。检测限为20μg/mL,定量限为50μg/mL;准确度结果均在90%~110%之间,精密度的RSD均<10%。水痘减毒活疫苗原液中的DMSO残留量均未检出。结论建立的气相色谱法能稳定、准确、快速地检测水痘减毒活疫苗原液中DMSO残留量,可适用于对水痘减毒活疫苗生产过程的质量控制。

Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果观察

目的观察Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的接种反应及免疫效果。方法选择乙脑低发区黑龙江省肇源县8月龄～10岁常住健康儿童为观察对象,按照免疫程序分别接种辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗(A组∶水针剂型;B组:冻干剂型)和市售乙脑灭活疫苗(对照组),观察接种后的不良反应,并采用蚀斑减少中和试验(PRNT)法检测血清乙脑中和抗体。结果A、B组疫苗的总不良反应率为2.81%,对照组为6.63%,3组均未出现严重不良反应,发热反应以轻度为主,局部不良反应较轻微,72h后全部消失。免疫后血清中和抗体阳转率A组为93.3%,B组为90.4%,对照组为81.8%;GMTA组为1∶24.0,B组为1∶21.8,对照组为1∶15.4。A组、B组的中和抗体阳转率和GMT均显著高于对照组,差异有统计学意义,3组之间中和抗体滴度的分布差异无统计学意义。结论辽宁成大生物股份有限公司生产的Vero细胞乙脑灭活疫苗不良反应率低,免疫效果良好。

Vero细胞制备流感病毒疫苗

目的利用转瓶培养Vero细胞制备流感病毒疫苗。方法将流感病毒接种于Vero细胞上培养,优化培养条件,收获的病毒液经灭活、超滤浓缩和层析纯化,检测病毒的血凝素(HA)滴度及血凝素含量。按此工艺制备流感疫苗,根据血凝素含量稀释为不同浓度,免疫小鼠,观察不良反应,并通过血凝抑制(HI)试验检测抗体水平。结果Vero细胞培养流感病毒的最佳条件为:维持液中胰酶浓度12.5～15μg/ml,pH值7.4～7.6,Vero细胞经多次洗换后再接种病毒,病毒在细胞上培养72～96h收毒。所有免疫小鼠均未出现不良反应,小鼠抗体阳转率均为100%,HI抗体滴度均不低于同剂量的阳性对照组。结论Vero细胞可用于流感病毒的培养和制备疫苗。

肾综合征出血热病毒84-Fli株单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndromes,HFRS)病毒特异性单克隆抗体。方法以汉坦病毒84-Fli株抗原纯化液免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得单克隆抗体,利用IFA、SDS-PAGE和Western blot法鉴定其生物学特性。结果成功筛选出阳性杂交瘤细胞株4F6,能稳定且持续分泌抗HFRS病毒的单克隆抗体,亚类鉴定结果为IgM,可与HFRS病毒蛋白在相对分子质量约50 000处发生特异性反应,具有较好的专属性。结论成功制备了1株抗HFRS病毒的单克隆抗体,为进一步研究该病毒感染的诊断、治疗及其预防方法奠定了基础。

甲型肝炎灭活疫苗(MRC-5细胞)中乙二胺四乙酸二钠残留量HPLC检测方法的建立及验证

目的建立检测甲型肝炎(hepatitis A,HA)灭活疫苗(MRC-5细胞)中乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)残留量的HPLC法,并进行验证。方法色谱条件:选用反相色谱柱;流动相为水相-有机相,水相为四丁基氢氧化铵的磷酸盐溶液,有机相为乙腈;流速为1.0 mL/min;检测波长为257 nm;进样量为20μL;柱温为30℃;保留时间为10 min。筛选色谱柱并优化流动相条件(水相与有机相的比例、pH及磷酸盐)。验证方法的适用性、专属性、线性范围、准确度、精密度、耐用性、定量限和检测限。采用该方法检测3批HA灭活疫苗原液供试品中EDTA-2Na残留量。结果最适色谱条件:采用美国Thermo公司的C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),水相与有机相比例为9∶1,pH为2.4,磷酸盐为0.01 mol/L磷酸二氢铵。EDTA-2Na对照品色谱峰的理论塔板数大于10 000,分离度大于1.5;仅对照品有色谱峰,且无其他色谱峰干扰;对照品在0.2~20μg/mL范围内线性关系良好,回归方程为Y=20 482.18 X+0.512 6,R^(2)=0.999 9;准确性验证中,浓度为2、5、10μg/mL的加标样品平均回收率分别为97.44%、100.6%及100.4%,RSD为1.6%;5μg/mL的加标样品重复性及中间精密度的RSD分别为1.4%和1.6%;定量限及检测限分别为0.2和0.05μg/mL;不同pH(2.0、2.4、3.0)流动相的色谱峰面积的RSD分别为0.24%、0.31%及0.18%,相对误差(RE)分别为99.25%、99.12%及99.33%。3批供试品均未检出EDTA-2Na。结论成功建立了检测HA灭活疫苗中EDTA-2Na残留量的HPLC法,该方法具有良好的专属性、线性范围、准确度、精密度及耐用性,为HA灭活疫苗的质量控制研究奠定了基础。

蚀斑法检测流感病毒滴度方法的建立及初步验证

目的建立流感病毒滴度蚀斑检测方法,研究其适用性,为基于Vero细胞基质的四价流感裂解疫苗原液生产过程提供质控手段。方法通过优化覆盖物琼脂糖含量、病毒吸附时间及培养温度等参数,建立蚀斑法检测流感病毒滴度检测的方法,对其进行初步验证,并与鸡胚法进行比较。结果通过对流感病毒培养条件的优化,确定覆盖物中最佳琼脂糖终浓度为1.0%(P=0.001,P<0.05)、最佳吸附时间为90 min(P=0.001,P<0.05),与对照差异具有统计学意义;不同温度(33℃、35℃和37℃)培养条件对病毒滴度的影响差异无统计学意义(P>0.05)。对病毒液重复性试验结果显示,由同一组试验人员连续测定8次,CV在3.73%~7.04%之间;同一组试验人员在不同工作日内对3批甲型(H3N2)病毒液测定,CV在3.46%~4.12%之间;不同试验人员测定结果的CV在1.77%~5.63%之间。表明蚀斑法重复性好、准确度高。蚀斑法与鸡胚法检测病毒滴度分别为7.84 lgPFU/mL和7.24 lgEID_(50)/mL,CV分别为2.90%(<5%)和10.21%。蚀斑法在流感病毒2017—2018年流行株病毒滴度检测中应用,均获得稳定的检测结果。结论建立的蚀斑法简便、稳定且灵敏度高,能够准确地检测流感病毒的滴度,可用于流感疫苗生产过程的质量控制研究。

细菌外膜囊泡在疫苗领域的研究进展

细菌外膜囊泡是一种主要由革兰阴性菌在其生长过程中正常分泌的球状物质。这种球状小泡在细菌的生存和信息传递中起到了重要的作用。同时,由于这种球状小泡携带大量的细菌毒力相关蛋白,并且不具有复制的能力。因此,是一种良好的潜在疫苗候选抗原。目前,关于细菌外膜囊泡的构成成分、分泌机制、生物学作用等方面的研究已非常广泛。同时,利用细菌外膜囊泡作为主要抗原的疫苗产品也已面世。现就细菌外膜囊泡的结构研究以及细菌外膜囊泡在疫苗领域的研究作一概述,以期为进一步推动细菌外膜囊泡疫苗的研发提供更多的参考。

四价流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量高效液相色谱检测方法的建立、验证及与比浊法的对比

目的建立四价流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法,对方法进行验证,并与比浊法进行对比。方法对HPLC法的流动相比例(水∶甲醇=30∶70、20∶80、10∶90)、流速(1.0、1.2、1.4 mL/min)、进样量(5、10、20μL)进行筛选,确定HPLC法的色谱条件。对HPLC法和比浊法分别进行验证,并对两种方法进行对比。结果 HPLC法的色谱条件为:采用BDS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:超纯水∶甲醇=20∶80;流速:1.2 mL/min;检测波长:230 nm;进样量:10μL;柱温:30℃。HPLC法中,Triton X-100色谱峰与杂质分离良好,在2~100μg/mL范围内线性关系良好,r为0.999 9;检测限为1μg/mL,定量限为2μg/mL,准确性和精密性良好。采用比浊法检测时,标准品在10~100μg/mL范围内线性关系良好,r为0.996 5,定量限为10μg/mL。结论与比浊法相比,HPLC法更适用于四价流感病毒裂解疫苗中Triton X-100残留量的测定。

铜绿假单胞菌疫苗候选株筛选及其类毒素对小鼠交叉保护性的初步评估

目的筛选多株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)菌株,提供可作为疫苗研发使用的备选菌株,并对其进行小鼠交叉保护性的初步评估。方法通过抗生素耐药性、毒力试验筛选铜绿假单胞菌疫苗候选株,采用不同孔径膜包(相对分子质量分别为300000、500000及1000000)对类毒素(toxoid)进行纯化工艺研究,并对其免疫原性及同源交叉保护性进行研究,评估候选株是否适用于疫苗研发。结果铜绿假单胞菌疫苗候选株均具有多重耐药性,尤其对四环素和氯霉素耐药性较高,分别为96.30%和88.89%,但对亚胺培南、环丙沙星敏感,耐药性仅为14.81%和18.52%。其中,耐受5种以上的占83.33%;毒力较强的菌株分别为PA101和PA36。类毒素经相对分子质量分别为300000、500000及1000000的孔径膜包处理后,与对照组相比类毒素收率分别为89.95%、95.52%及97.99%;内毒素残留量分别为≤107.39 EU/μg蛋白、≤101.13 EU/μg蛋白和98.58~985.80 EU/μg蛋白;与对照组相比,500000组类毒素热原检测为阴性;免疫原性结果表明500000组、1000000组与对照组一致,均≥70%。与PA36比较,PA101类毒素对疫苗候选株免疫原性均≥70%。除PA15和PA46外,13株同源菌株交叉保护性在50%~100%之间,其中保护性≥70%的占92.31%。结论铜绿假单胞菌PA101类毒素抗原对候选菌株具有保护性,对同源其他菌株也具有一定的保护性作用,为后续铜绿假单胞菌医院获得性感染性的预防研究提供了数据支持。

金黄色葡萄球菌多组分疫苗制备及对小鼠的保护性评价

目的筛选多株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)菌株,为疫苗研发提供备选菌株,并对多组分金黄色葡萄球菌疫苗进行小鼠交叉保护性初步评估。方法通过菌株耐药性、毒力试验筛选获得金黄色葡萄球菌候选菌株;优化菌体破碎和酶解条件获得胞质抗原,并对胞质抗原进行免疫保护性研究以确定最佳免疫剂量;采用抗体中和滴度方法评价类毒素抗原免疫效果;采用多组分疫苗对候选株免疫保护性及同种属其他菌株的交叉保护性进行试验研究。结果 12株金黄色葡萄球菌候选菌株均具有多重耐药性,且对庆大霉素、环丙沙星及苯唑西林的耐药性都比较高,均为83.33%,但都对万古霉素敏感;菌株SA59和SA79毒力分别为34.19 LD50和11.96 LD50;菌体破碎最佳条件为3~4次,破碎率达到90%以上,胞质抗原酶解的最佳条件为600 mg胞质抗原在2~4 mg胰蛋白酶条件下,消化至少2 h,抗原含量基本保持不变;SA79胞质抗原免疫剂量不低于1.0 mg/mL时,保护率均>70%。类毒素抗原5 EC/mL (A组)、8 EC/mL(B组)和10 EC/mL(C组)免疫小鼠后,血清中抗体中和效价均值分别为2.13、3.13和3.50 AE/mL,B组和C组免疫后的抗体中和效价差异无统计学意义(PBC=0.224,P>0.05),但均高于A组,具有统计学意义(PAB=0.008,PAC=0.001,P<0.05)。多组分疫苗对候选菌株SA79、SA59的保护率分别为80%和70%,对外毒素的保护率为60%;多组分疫苗对同种属其他菌株的交叉保护率在50%~100%之间,保护率均≥50%。结论多组分金黄色葡萄球菌疫苗对候选株具有保护性,也对同种属其他菌株具有保护性,为后续预防用金黄色葡萄球菌疫苗的工艺开发提供数据支持。