人端粒酶反转录酶稳定转染成骨细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:建立端粒酶反转录酶(humantelomerasereversetranscriptasehTERT)基因稳定转染的成骨细胞,构建组织工程骨。方法:克隆hTERTcDNA编码区,构建hTERT表达载体,培养并鉴定成骨细胞,确定成骨细胞G418耐受含量,hTERT基因稳定转染成骨细胞并传代培养,制备组织工程骨,植入动物体内,观察骨折愈合的情况和进程。结果:成功的克隆了hTERTcDNA编码区,构建了hTERT表达载体并将hTERT稳定转染于成骨细胞中。经hTERT稳定转染的成骨细胞其构建的组织工程骨治愈骨折愈合的情况和进程明显好于未经转染的成骨细胞组织工程骨。结论:经hTERT稳定转染的成骨细胞,能有效的延长成骨细胞的寿命防止细胞老化,并保持成骨细胞的功能特性。

人端粒酶反转录酶cDNA编码区的克隆及重组表达载体的构建用于延长组织工程种子细胞寿命的研究

目的:克隆人端粒酶反转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)cDNA编码区,构建hTERT重组表达载体,用于延长组织工程种子细胞的寿命。方法:利用具有hTERT表达特异性标志(expressionspecifictag,EST)的商品化cDNA克隆,克隆hTERTcDNA编码区,选择Gateway基因克隆表达系统,将hTERT克隆到Gateway系统的入门载体后,通过LR重组反应,将hTERT分别构建到了天然状态表达载体pcDNA3.2-DEST表达载体和GFP报告基因pDEST53表达载体,同时进行了hTERT细胞定位研究和表达状态研究。结果:使用ESTcDNA克隆进行hTERTcDNA编码区基因克隆,获得了成功。构建了hTERT重组表达载体。克隆的hTERT编码区表达的hTERT蛋白成簇分布在细胞核内,重组的hTERT保持了天然hTERT的特性。结论:使用ESTcDNA克隆进行基因克隆,提供了一种快速进行基因克隆的方法。通过DNA序列分析和hTERT细胞内定位及表达分析,证实了克隆的hTERT编码区序列的正确性和生物学功能,为今后延长组织工程种子细胞的寿命奠定了基础。

成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性

目的 探讨成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性。 方法 取 2周龄乳兔颅盖骨及肾脏皮质传代培养制备成骨细胞 ( A组 )、血管内皮细胞 ( B组 )及成骨细胞与血管内皮细胞联合培养 ( C组 ) ,用 型胶原和血管 因子免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞和血管内皮细胞 ,倒置相差显微镜和组织学染色观察细胞的生长特性和细胞相容性 ,检测碱性磷酸酶 ( alkaline phosphatase,AL P)活性 ,观察血管内皮细胞对成骨细胞产生的 AL P活性有无影响 ,MTT法检测细胞活力 ,分析细胞生长和增殖情况。 结果 免疫细胞化学染色证实 ,培养的细胞为成骨细胞和血管内皮细胞。倒置相差显微镜、HE和 Masson染色均显示两种细胞混合生长良好。AL P检测结果 :C组 AL P活性明显高于 A组和 B组 ( P<0 .0 1) ,A组高于 B组 ( P<0 .0 5 )。 MTT检测结果表明 :C组细胞早期增殖较慢 ,而后期增殖较快。 结论 成骨细胞与血管内皮细胞具有良好的相容性 ,血管内皮细胞能够增强成骨细胞的 AL P活性 ,提高成骨细胞的增殖能力。