医学院校仪器分析实验教学模式探索

仪器分析作为一门随科学发展日益更新的专业课程,具有很强的实践性。针对不同层次、不同专业特点进行仪器分析实验教学的改革和实践,探索仪器分析实验教学的新思路,旨在培养高素质、创新型、应用型人才。

PDGF诱导大鼠主动脉平滑肌细胞迁移模型的建立

[目的]建立PDGF诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(A7r5)迁移的模型。[方法]采用改良的Boyden小室法,以不同浓度(1、5、10、20、50和100 ng/mL)PDGF-BB为诱导剂,将不同浓度(1×105/mL、2×105/mL、4×105/mL)的A7r5细胞置入Boyden小室,分别培养5、7、9 h。迁移膜经Giemsa染色后,显微镜下观察迁移到下室的细胞,进行细胞计数。[结果]在无PDGF诱导时,迁移细胞数为每视野10个左右;而以10 ng/mL PDGF-BB诱导时,迁移细胞数每视野可达70个左右;当PDGF浓度达到100 ng/mL时,细胞迁移数降至每视野10个左右。随细胞浓度的增高,迁移细胞数目增加,细胞浓度为1×105/mL时,7 h迁移细胞数目为(48±8.944)个;2×105/mL细胞在5 h左右发生迁移的数目为(55±12.864)个,随时间延长而增多,在7 h前后增幅最明显,达(78±15.828)个(P<0.05);但细胞浓度为4×105/mL时,7 h迁移细胞数为(84±12.213)个(P>0.05)。[结论]以10 ng/mL PDGF-BB为诱导剂,以2×105/mL浓度接种,培养7 h建立的迁移模型为最佳。

清胰汤对大鼠急性坏死性胰腺炎时胰腺腺泡细胞凋亡的影响

目的:研究清胰汤对大鼠急性坏死性胰腺炎时胰腺腺泡细胞凋亡的影响。方法:选用健康雄性SD大鼠30只,随机分为假手术组、模型组和清胰汤治疗组,每组10只。采用TUNEL技术检测胰腺腺泡细胞的凋亡;RT-PCR检测胰腺组织Bax和Caspase-8mRNA的表达;免疫组化分析胰腺组织Bax和Caspase-8蛋白表达。结果:与模型组比较,清胰汤组大鼠胰腺腺泡细胞凋亡显著增多(P<0.01),BaxmRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);血清淀粉酶及TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05),胰腺组织病理损害明显减轻。结论:清胰汤可能通过上调Bax基因的表达促进胰腺腺泡细胞凋亡,减轻胰腺组织病理损害。

培养平滑肌细胞原位包埋超薄切片的制备

[目的]探讨培养平滑肌细胞透射电镜制样方法。[方法]将平滑肌细胞培养在3.5 cm的塑料培养皿上,连同培养皿一起进行固定、脱水、浸透,然后将培养皿切开,一部分倒扣包埋,另一部分切成小条,放入胶囊中包埋,聚合后超薄切片,透射电镜横向和纵向观察细胞的超微结构。[结果]完整保存了细胞生存状态时的超微结构;在倒扣包埋后横向切片中,细胞内有大量线粒体、内质网、微管、微丝等;纵向切片中,可见细胞连接和细胞突起。[结论]利用原位包埋超薄切片技术可以对贴壁细胞进行制样,在电镜下观察贴壁细胞超微结构。

乙型肝炎患者外周血单个核细胞HBV cccDNA含量的检测及其临床意义

[目的]采用实时荧光定量PCR的方法检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量,并探讨其临床意义。[方法]应用实时荧光PCR(RT-PCR)方法对随机选取的乙型肝炎患者100例和1例追踪治疗的乙肝患者的血清HBV DNA含量和外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量进行检测;对已确诊的慢性乙肝患者40例,肝硬化患者30例外周血单个核细胞中HBV cccDNA的含量进行检测。[结果]100例乙型肝炎患者中,HBVDNA含量<5×102copies/mL有57例,HBV cccDNA的含量均<5×102copies/mL;HBV DNA含量>5×102copies/mL有43例,HBV cccDNA的含量>5×102copies/mL有22例;HBV DNA含量>1×103copies/mL的患者有17例,在这些患者中HBV cccDNA的含量>5×102copies/mL者为13例,两者之间比例经χ2检验,差异无显著性意义,P>0.05;肝硬化患者HBV cccDNA阳性率(>5×102copies/mL)为67.7%,远远高于慢性乙肝患者的42.5%和随机乙肝人群的22.0%。各组间患者比例经χ2检验,差异有显著性意义,P<0.05。[结论]乙型肝炎患者进行外周血单个核细胞中HBV cccDNA的检测,对于抗病毒治疗效果的监测和预后判断都重要的临床意义。

DEC205在幽门螺杆菌感染的巨噬细胞中的表达

目的:探讨幽门螺杆菌(H pylori)感染与巨噬细胞表面的胞吞受体DEC205的关系.方法:用蛋白纯化法提取得到H pylori-HSP60.分别用H pylori、H pylori-HSP60和E.coli-LPS刺激单核细胞(NOMO1)后提取蛋白进行免疫印迹法分析.利用PMA将NOMO1细胞分化成巨噬细胞,再用H pylori或H pylori-HSP60刺激细胞后提取RNA进行实时PCR分析;细胞表面DEC205抗原的表达通过流式细胞术进行分析.结果:H pylori的刺激能明显引起DEC205蛋白的表达,而H pylori-HSP60或E.coli-LPS的刺激只引起了少许DEC205蛋白的表达;经PMA分化后的NOMO1细胞表面DEC205mRNA的表达增强,分化后的NOMO1细胞被H pylori或H pylori-HSP60刺激后也增强了DEC205mRNA的表达;流式细胞术结果表明NOMO1细胞在H pylori刺激后,细胞表面DEC205抗原的表达明显增加(88.10%vs7.84%,P<0.05),而且当NOMO1细胞被PMA分化后,经H pylori或H pylori-HSP60刺激后DEC205表达也有所增高(74.73%,51.31%vs43.77%,均P<0.05).结论:H pylori感染与巨噬细胞表面的胞吞受体DEC205有着密切的联系.

悬浮细胞扫描电镜快速制样方法

电镜用于某些疾病的病理检查已为广大医务工作者熟知。但电镜样品常规制备的方法时间长，约需要2d，影响及时诊断。我们参考有关文献^[1,2]，在实践工作中，经过多次实验，总结出电镜诊断的快速制样方法。该方法不仅缩短了样品制备时间同时还可以满足电镜诊断要求。现将电镜快速制备方法报告如下。

应用流式细胞仪的常见问题及解决对策

针对流式细胞仪在生物样品检测中的常见问题,介绍从荧光素的选择、荧光补偿、设门及参数优化几个方面所采取的对策。

肌球蛋白轻链激酶非激酶活性调节磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为进一步阐明MLCK非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用,利用已删除部分激酶区域的MLCK重组体(pGEX-F6.5)在大肠杆菌中进行表达,采用亲和层析技术纯化表达的MLCK片段,应用EnzChek磷分析试剂盒检测MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、水解重酶解肌球蛋白(heavy meromyosin,HMM)及肌球蛋白亚片段1(subfragment1,S1)ATP酶活性的影响,体外检测MLCK片段对肌动蛋白肌丝运动的调节.研究结果显示,pGEX-F6.5重组表达载体在大肠杆菌中以可溶性GST融合蛋白的形式表达.该融合蛋白经Glutathione-Sepharose4B纯化、SDS-PAGE鉴定得到较纯的单一表达条带.纯化的MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、HMM和S1的ATP酶活性均有明显激活作用.MLCK片段激活磷酸化肌球蛋白ATP酶活性为:Vmax=(19.426±1.669)倍;Km=(0.486±0.106)μmol/L,MLCK片段对磷酸化HMM和S1的ATP酶活性也有相似的刺激作用.体外肌丝运动研究表明,随着MLCK片段浓度的增加,磷酸化肌球蛋白与肌动蛋白结合的数量不断增加,肌丝运动的速度也随之增加.上述结果表明,MLCK的C端非激酶活性具有调节磷酸化的肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动的作用.

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP酶活性的调节

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6·5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段(F6·5和F6·5/D),经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段(F6·5)使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.

石蜡半薄切片制作透射电镜的方法

[目的]介绍石蜡半薄切片转制透射电镜的制样方法。[方法]对石蜡半薄切片进行脱蜡、水化、锇酸固定、缓冲液漂洗、梯度酒精脱水、环氧树脂包埋、超薄切片机切片、透射电镜下观察。[结果]组织细胞的超微结构保存完好,足以满足病理诊断之用。[结论]用石蜡半薄切片转制电镜比用石蜡组织块转制电镜方法简单,快速易行。

高效液相色谱法同时测定人血清中维生素A、D_3、E的含量

目的:建立双通道高效液相色谱法同时测定人体血清中维生素A、D_3、E的含量,以诊断维生素缺乏症,监视营养状况。方法:取血清100μL,加入100μL乙醇,震荡,加入0.7 mL正己烷萃取,通氮气将正己烷提取液挥发干后用乙醇溶解,进样分析。色谱条件:色谱柱为Nova-Pak C_(18)(3.9 mm×150 mm,4μm),流动相为甲醇-水(95:5),流速为1.5 mL·min^(-1),检测波长维生素A、E为300 nm,维生素D_3为265 nm。结果:维生素A在0.10～0.90 mg·L^(-1)范围内呈线性关系,r=0.999 9,维生素D_3在5.00～45.00 mg·L^(-1)范围内呈线性关系,r=0.999 3,维生素E在1.00～40.00 mg·L^(-1)范围内呈线性关系,r= 0.997 0;维生素A、D_3、E的平均回收率分别为94.7%,90.2%,98.8%。结论:本方法快速、灵敏、准确,简便易行。

RP-HPLC法测定人血清中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸含量

[目的]建立RP-HPLC法测定人体血清中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸含量的方法。[方法]用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生;氨基酸的衍生物用Nova-Pak C18（3.9 mm×150 mm,4μm）分离;流动相A为30%甲醇、2%四氢呋喃、68%磷酸缓冲液（0.1 mol/L,pH 6.8）,流动相B为100%甲醇,用二元线性梯度程序洗脱;荧光检测器检测,激发光波长280 nm,发射光波长340 nm。[结果]在（4-400）nmol/mL范围内,各组分线性关系良好,各氨基酸的平均回收率为90.0%-93.1%。[结论]本方法操作简便、准确,适用于人体血清中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和γ-氨基丁酸浓度的测定。

冷冻保存Epon812包埋剂在电镜样品制备中的应用

[目的]探讨冷冻保存Epon812包埋剂及其再利用的方法。[方法]将电镜样品制备中剩余包埋剂在特定条件下冷冻保存,需要时解冻,进行常规浸透包埋。比较包埋剂冷冻前后超薄切片的切割性能。[结果]用冷冻后复温的包埋剂制备的包埋块,超薄切片时切割性能良好,两种包埋剂制备的样品各项观察指标无明显差异。[结论]冷冻保存Epon812包埋剂及其再利用的方法是可行的。

冷冻保存连续冰冻切片在免疫组化染色中的应用

[目的]探讨科研工作中使用连续冰冻切片进行免疫组化染色时切片的保存方法。[方法]将不能马上完成染色的连续冰冻切片采用干燥、密封的方法置于-80℃保存,需要时取出自然干燥后进行常规免疫组化染色。[结果]使用冷冻保存的冰冻切片进行免疫组化染色,组织结构清晰完整,细胞境界分明,染色对比度好,特异性抗原标记明显,与未经冷冻的新鲜切片比较各项观察指标无明显差异。[结论]-80℃冷冻保存冰冻切片的方法是可行的。

DEC205在幽门螺杆菌感染的胃黏膜中的表达

目的:探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染的胃黏膜与DEC205的关系.方法:对13名H.pylori感染阳性患者的胃黏膜进行内窥镜活检,以及对这13例中7例被根除H.pylori的患者的胃黏膜进行二次内窥镜活检,活检标本行冰冻组织切片后,分别进行DEC205抗体的免疫组织化学染色,以及进行DEC205抗体和CD14抗体的免疫荧光染色.结果:对比除菌成功H.pylori阴性的患者,H.pylori阳性患者胃小凹处的胃黏膜上皮细胞间DEC205的表达明显增多.胃黏膜中,DEC205与CD14表达在同一个位置,而且DEC205与CD14的表达在H.pylori感染胃黏膜中明显高于除菌成功的H.pylori阴性的患者.结论:胞吞受体DEC205在H.pylori感染的胃黏膜巨噬细胞中呈高表达.

奥林巴斯BX51系统显微镜使用中常见故障排除与日常维护

显微镜是观察物质微观结构的重要工具，是现代科学尤其是医药科研方面的重要仪器之一。工作中对显微镜精心维护和保养，可保证显微镜清晰度高，选择任意图像拍照。如果日常维护和保养不到位，就会导致显微镜不能处于最佳状态，影响图像拍照，就不能获得清晰显微镜照片。

指导研究生电镜取材的体会

电子显微镜技术现已广泛用于科研、医学领域，用于临床诊断。对于疾病的治疗提供可靠的依据。我们电镜室工作人员主要负责电镜制样工作，但是取材是由研究生和科研人员亲自操作，标本取好后，放入2．5％戊二醛固定后送到我们电镜室。在取材过程中出现的问题最多，如果方法不正确将导致实验结果失败，所以电镜取材是整个样品制备过程中的关键步骤之一。研究生肩负着建设国家的重任，是国家的栋梁，培养研究生是我们当老师的责任。下面是如何指导研究生电镜取材和取材过程中出现的一些问题及怎样解决做一介绍，介绍如下：